实验 影响酶促反应速度的因素
酶 生化试验报告
生物大分子·酶——相关生化实验报告小组成员：王书洋张斌贾官斐杨翀左天宇单位：武警后勤学院临床医学系四队四班邮编：300162关键词淀粉酶; 活性; 温度; 抑制剂; 激活剂; 专一性【前言】目前临床主要以检测指标作为依据对疾病的诊断作出较为准确的判断。
其中，酶学上的应用占了相当一部分。
所以，从临床疾病诊断以及治疗的角度去对酶学知识的具体化了解和应用深化是十分有必要的。
酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化。
因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。
酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
对酶活性的测定对临床诊断以及基础医学的研究都有着重要意义。
很多酶其实包含几种具有同样催化效用的蛋白质，但它们的分子组成、理化性质与免疫学特性却有明显差异，这类蛋白质统称为该酶的同工酶。
同工酶在组织和器官中的分布不同，通过测定不同同工酶的含量与活性的变化，可以推算出改组织和器官的变化。
本综述旨在对后文的三次实验作为基础医学和临床医学的一次应用上的联系。
实验一影响酶促反应速度的因素【实验原理】唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。
淀粉溶液与碘反应呈蓝色；糊精根据分子大小，与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色；麦芽糖不与碘呈色。
唾液淀粉酶的活性受温度、酸碱度、抑制剂与激活剂等的影响。
温度：温度降低，酶促反应减弱或停止；温度升高，反应速度加快。
当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。
由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋白质构象的改变，因此如果温度继续升高，反应速度反而会迅速下降甚至完全丧失。
酸碱度：唾液淀粉酶最适pH为pH6.9，高于或低于酶的最适pH值，都将引起酶活性的降低，过酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。
抑制剂与激活剂：酶的活性常受某些物质的影响，能增加酶的活性称为酶的激活剂：降低酶活性且不使酶蛋白变性的称为酶的抑制剂。
实验22 影响酶促反应因素——温度、
1.实验目的
（1）通过本实验了解pH、温度、抑制剂对 酶活力的影响。 （2）通过实验掌握控制变量法，并能使用控 制变量法设计实验。
2.实验原理
本实验通过对胰蛋白酶的测试，考察温 度、pH、抑制剂对酶活性的影响。 （1）温度的影响：酶是生物体内一类具 有催化活性的蛋白质，与一般催化剂一样 存在温度效应。开始时，酶促反应的速率 随温度的增加而增加，达到最大反应速率 时的温度为酶的最适温度，而超过最适温 度，会引起蛋白质变性，使酶促反应速率 降低直至停止。
（2）pH组 设置空白组：取一支试管，加入1.0mL1%酪 蛋白溶液和3.0mL5%三氯乙酸溶液，摇匀后加入 0.2mL酶液和0.8mL蒸馏水，在37oC下恒温10min。 对pH的测试：取3支试管，依次编号1、2、3， 向3支试管中分别加入0.2mL胰蛋白酶溶液，向1 号试管中加入0.8mLpH=7.4的硼酸缓冲液，向2号 试管中加入0.8mLpH=8.0的硼酸缓冲液，向3号试 管中加入0.8mLpH=9.0的硼酸缓冲液，上述试管 置于37oC水浴中恒温2min，然后加入各加入 1.0mL1%酪蛋白溶液，在37oC水浴中继续恒温 10min后加入三氯乙酸切断反应。将上述试管以 3000r/min离心5min，取上清液在280nm波长测定 吸光度。
（3）抑制剂组 设置空白组：取一支试管，加入1.0mL1%酪蛋 白溶液和3.0mL5%三氯乙酸溶液，摇匀后加入 0.2mL酶液和0.8mL蒸馏水，在37oC下恒温10min。 对抑制剂作用的测试：取两支试管，编号1、2， 在两支试管中分别加1.0mL1%酪蛋白溶液，然后 在1号试管中加入0.8mL蒸馏水，在2号试管中加 入0.1mL1mmol/mL苯甲脒溶液和0.7mL蒸馏水， 在37oC水浴中恒温2min，然后向两支试管中各加 入0.2mL的胰蛋白酶溶液，在37oC水浴中继续恒 温反应10min，最后加入三氯乙酸终止反应。将 上述试管以3000r/min离心5min，取上清液在 280nm波长测吸光度。
影响酶促反应的因素
酶的竞争性和非竞争性抑制可通过双倒数作图加以区 不因竞争性抑制剂的存在而改变， 别。Vmax不因竞争性抑制剂的存在而改变，Km则不因非 不因竞争性抑制剂的存在而改变 则不因非 竞争性抑制剂的存在而改变。 竞争性抑制剂的存在而改变。
固定酶反应的其它条件，在不同pH处测定酶反应速度，可 得各种类型的酶活性与pH关系
生化学家将酶活性最高处的pH称为最适pH。一般来说，血 清中大多数酶最适pH接近中性（pH6.5-7.5）。有些酶在最适 pH处活性变化尖锐明显，也有些平坦宽广。测定酶活性浓度时 一定要选择在最适pH处，不仅因为此处酶反应速度最大，测定 灵敏度最高，还因为此处酶活性变化的斜率最小，如反应体系 中出现pH变化时，对测定结果影响最小。
2. 专一性不可逆抑制
此属抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行 共价结合，从而抑制酶的活性。有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱 酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。 当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，胆碱能神经末稍分泌的乙酰 胆碱不能及时分解，过多的乙酰胆碱会导致胆碱能神经过度兴奋 的症状。解磷定等药物可与有机磷杀虫剂结合，使酶和有机磷杀 虫剂分离而复活。
五、pH对酶的作用 pH对酶的作用
当pH变化时，可影响到底物、酶、酶-底物复合物的解离状 态和构型，甚至还可能影响到各种辅因子，从而影响酶活性。 PH对酶还有一个重要的作用，就是影响酶的稳定性。 最适pH并非是酶的特征性常数，易受多种因素影响而改变， 如缓冲液的种类、底物浓度、温度等，在研究pH对酶稳定性影 响还应注意到酶浓度高低，在低浓度时，酶易解离为单体，常比 多聚体更易灭活。
(二)可逆性抑制(reversible inhibition) 可逆性抑制(reversible
酶促动力学
H C
S CHCl E S As
H C
CHCl + 2HCl
巯基酶
S E S
路易士气
H2C SH
失活的酶
酸
H As C CHCl + HC SH H2C OH
H SH H2C S As C CHCl + HC S E SH H2C OH
失活的酶
BAL
巯基酶 BAL与砷剂结合物
三、酶的抑制作用
（五）一些重要的抑制剂
*竟争性抑制举例
1.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制
琥珀酸
琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2
延胡索酸
COOH CH2 C H2 COOH 琥珀酸
COOH CH2 COOH 丙二酸
•
磺胺类药物的抑菌机制
与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶
二氢蝶呤啶 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸
二氢叶酸 合成酶 二氢叶酸
H2N
加入非竞争性抑制 剂后，Km 不变，而 Vmax减小。
非竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图 ：
加入非竞争性抑制剂 后，Km 不变，而 Vmax减小。
非竞争性抑制剂与酶活 性中心以外的基团结合。 这类抑制作用不会因提高 底物浓度而减弱
三、酶的抑制作用
(二) 抑制作用的类型
（3）反竞争性抑制
影响因素包括有
底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂、酶浓度等。
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
影响酶促反应速率的因素：
底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH 值 抑制剂I 激活剂A
二、底物浓度对酶反应速度的影响
355
当底物浓度达到一定值 反应速度达到最大值 （Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加
酶促反应动力学实验报告
酶促反应动力学实验报告14301050154 杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：管号试剂2.另取9支试管编号，做酶促反应：管号试剂3.混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。
实验九 底物浓度对酶促反应速度的影响
0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6
8
10
1/[S](1/m ol.L ) m
实验时选择不同的[S]， 测定相对应的υ 实验时选择不同的 [S]，测定相对应的 υ。 求 [S] 出两者的倒数， /υ对 /[S]作图 作图， 出两者的倒数 ， 以 1/υ 对 1/[S] 作图 ， 则得到一 个斜率为K /V的直线 将直线外推与横轴相交， 的直线。 个斜率为 Km/V 的直线 。 将直线外推与横轴相交 ， 其横轴截矩为：－ /[S]＝ ：－1 由此求出K 其横轴截矩为 ：－ 1/[S] ＝ 1/ Km ， 由此求出 Km 值 。 该法比较简便。 该法比较简便。 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用 Lineweaver-Burk双倒数作图法测定 双倒数作图法测定K Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。 胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸（ 胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸（ L －精 氨酸和L － 赖氨酸） 的羧基所形成的肽键水解。 氨酸和 L 赖氨酸 ） 的羧基所形成的肽键水解 。 水解时生成自由氨基酸， 水解时生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判断 自由氨基增加的数量来追踪反应。 自由氨基增加的数量来追踪反应。
【实验结果】 实验结果】 1．测定并计算酶促反应速度。 测定并计算酶促反应速度。 2．用实验所得的反应速度，对相应的底物浓 用实验所得的反应速度， 度作图。 度作图。
【实验报告】 实验报告】 总结实验结果，并回答如下问题： 总结实验结果，并回答如下问题： 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 1． 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 在什么条件下，测定酶的Km Km值可以作为鉴 2． 在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴 定酶的一种手段，为什么？ 定酶的一种手段，为什么？ 米氏方程中的Km值有何实际应用？ Km值有何实际应用 3． 米氏方程中的Km值有何实际应用？
“影响酶促反应速度的因素”教学设计与反思
广东职业技术教育与研究2019年第1期1教学目标1.1知识与技能掌握底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。
熟悉米-曼氏方程式、V max及K m的意义。
了解单一变量原则实验探究法和酶促反应在医学上的应用，提高学生的学习兴趣。
1.2过程与方法教学以PPT方式为主，借助图表、动态图画展示。
课堂举例讲授，掌握对照法的理论基础。
通过知识拓展，学以致用，锻炼学生自主学习的能力。
通过实验探究，学生根据实验原理讨论分析得出实验结论，实现一体化教学。
1.3情感与价值培养学生提出问题、解决问题的能力。
结合临床、日常生活的实例，拉近学生和生化的距离，让学生感知生化就在我们的身边，生化源于生活，激发学生学习生化的兴趣。
2教学重难点2.1教学重点底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。
2.2教学难点米-曼氏方程式、V max及K m的意义。
3学情分析授课对象为高职护理、助产专业一年级的学生。
经过第一学期对无机化学和正常人体学的学习，已经具备一定的生物和化学学科基础。
思维活跃，充满好奇心，学习能力较好。
但是抽象逻辑性、独立性仍有待加强，学习强度伴随学习课程难度的提高而下降。
依赖心理较强，希望得到教师关注、督促、激励和赞许。
4课程分析生物化学是众多医学课程的基础，起到承前启后的作用。
全书的内容以抽象为主。
本章前面已经介绍了酶的分子结构与功能、酶促反应的特点与催化机制。
在此基础上，定量描述了6种因素，分别是底物浓度、酶的浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响，具有理论性强、内容枯燥、理解难等特点。
它是酶的结构对功能影响的进一步讨论，也是后面物质代谢章节的理论基础。
解释了低温保存疫苗、低温麻醉的原理［1］。
5教学内容及方法【复习回顾】①从酶的分子结构开始，结构决定功能，酶的功能是催化作用和代谢调节元件。
②酶促反应的表达式（单底物、单产物的反应）。
【教学方法】通过对学生进行集体提问，起温故而知新的作用。
底物浓度对酶促反应速度的影响
1/[S] 1/Vm
（林－贝氏方程）
2. Hanes作图法 在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S]
[S]/V
[S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax
Km/Vm
-Km
[S]
Km与Vmax的意义
Km值 定义：Km等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底 物浓度。 意义： 1.Km是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、底物 和反应环境（如，温度、pH、离子强度）有关， 与酶的浓度无关。
2.Km可近似表示酶对底物的亲和力；
3.同一酶对于不同底物有不同的Km值。
• Km最小的底物大多数是此酶的天然底物 如：己糖激酶对葡萄糖的Km 1.5mmol/L 对果糖的Km 所以葡萄糖为最适底物 • 一种酶对每一种底物都各有一个特定的Km 28mmol/L
V
Vmax
[S]
当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比； 反应为一级反应。
V
Vmax
[S]
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速； 反应为混合级反应。
V
Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度； 反应为零级反应
（一）米－曼氏方程式揭示单底物反应的 动力学特性 解释酶促反应中底物浓度和反应速率关 系的最合理学说是中间产物学说： E+S
推导过程
• 稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 [ES]恒定。
K1 ([Et]－[ES]) [S]＝K2 [ES] + K3 [ES]
整理得：
K2+K3 ([Et]－[ES])[S] (2) ＝ [ES] K1 K2+K3 令： ＝ Km （米氏常数） K1
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实验影响酶促反应速度的因素
一、实验目的
通过本实验了解温度、PH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。
二、实验原理
唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。
淀粉溶液与碘反应呈蓝色；糊精根据分子大小，与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色；麦芽糖不与碘呈色。
唾液淀粉酶的活性受温度、酸碱度、抑制剂与激活剂等的影响。
温度：温度降低，酶促反应减弱或停止；温度升高，反应速度加快。
当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。
由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋白质构象的改变，因此如果温度继续升高，反应速度反而会迅速下降甚至完全丧失。
酸碱度：唾液淀粉酶最适pH为pH6.9，高于或低于酶的最适pH值，都将引起酶活性的降低，过酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。
抑制剂与激活剂：酶的活性常受某些物质的影响，能增加酶的活性称为酶的激活剂：降低酶活性且不使酶蛋白变性的称为酶的抑制剂。
如Cl-为唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。
根据上述性质，可以用碘检查淀粉是否水解及其水解程度，间接判断唾液淀粉酶是否存在及其活性大小。
三、试剂及器材
1.试剂：
1％淀粉溶液，1％氯化钠溶液，1％硫酸铜溶液，1％硫酸钠溶液，碘液，磷酸氢二钠（0.2mmol/L）, 柠檬酸溶液(0.1mmol/L)。
2.器材：
试管，试管夹，恒温水浴锅(37℃),吸管，滴管，试管架。
四、实验操作：
1.收集唾液：实验者先将痰咳尽, 用自来水漱口, 清除口腔内食物残渣, 再含蒸馏水约15 mL, 作咀嚼咕漱运动, 3min后吐入小烧杯中备用。
2.观察温度对酶促反应速度的影响
取试管3支，编号1,2,3，按下表操作：
3. 观察pH对酶促反应速度的影响
（2）取试管3支，编号1,2,3，按下表操作：
4观察激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响
取试管4支，编号1,2,3,4，按下表操作：
五、实验结果及分析
六、思考题
影响酶促反应速度的因素有哪些？它们如何影响酶的活性？。