噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
噬菌体展示技术的原理及应用
8、 DNA结合蛋白：
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结 构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别 和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用 于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指 的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸 序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞 系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干 扰病毒感染插入的片段是从 某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片 段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可 利用M13 噬菌体或其他表 达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬 菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一 个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论 如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质 之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展 示提供了一个应用免疫学方法进行酶：
例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等
6、底物与抑制剂：
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如 凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促生素、 αbungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折叠区域， 如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离 到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的 多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的 高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体 信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛 选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史
Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原 决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增 生，表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面，并提出通过构建随机 肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选 溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广泛应用的时代。
噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展
2010.012010.01的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。
与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。
其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。
3噬菌体肽库的筛选技术如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。
经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。
3.1宿主菌直接洗脱经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。
利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。
3.2双层膜筛选系统获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。
通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。
针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。
第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。
细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。
这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选效率。
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究一、概述在生物医学领域中，脑靶向递药系统一直是研究的热点和难点。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效进入大脑，从而限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
开发新型的脑靶向递药技术，对于提高药物在脑部的浓度和疗效，降低副作用具有重要意义。
噬菌体展示技术以其独特的优势在药物研发和生物医学领域得到广泛应用。
该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。
利用噬菌体展示技术，我们可以筛选到与特定靶标具有高亲和力的多肽或蛋白，为药物研发和疾病治疗提供新的候选分子。
本研究旨在利用噬菌体展示技术筛选具有脑靶向功能的多肽，并将其修饰到纳米粒表面，构建新型的脑靶向递药系统。
通过优化筛选条件和方式，我们成功获得了多个具有脑靶向功能的多肽序列，并通过实验验证了其脑靶向性。
我们还将这些多肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物（PEGPLGA）纳米粒表面，以提高药物的稳定性和脑部递送效率。
本研究不仅为脑靶向递药系统的开发提供了新的思路和方法，还为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的候选药物和递送策略。
通过进一步的研究和优化，我们相信这种新型的脑靶向递药系统将在未来为更多的患者带来福音。
1. 介绍脑靶向药物递送的重要性与挑战脑靶向药物递送是神经科学领域的一个关键研究方向，对于治疗脑部疾病具有重要意义。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效穿透并进入脑组织，这使得脑内疾病的治疗面临着巨大的挑战。
开发高效的脑靶向药物递送系统成为当前研究的热点和难点。
脑靶向药物递送的重要性主要体现在以下几个方面：对于脑部疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、脑肿瘤等，有效的药物递送能够显著提高治疗效果，改善患者的生存质量。
脑靶向递送系统能够实现药物的精准定位，减少对其他组织器官的副作用。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术第一篇：噬菌体展示技术介绍噬菌体作为一种针对细菌的病毒，与我们生活息息相关。
除了作为抗生素的发现者，噬菌体还可以被利用于噬菌体展示技术。
这种技术利用噬菌体表面展示的蛋白质，实现对目标蛋白质的快速筛选和鉴定。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、优缺点，以及在生命科学研究和工业生产中的应用。
一、原理噬菌体展示技术是将目的蛋白或肽插入噬菌体表面的一种方法。
噬菌体表面组分主要有三种：1）编码质粒的pIII蛋白质；2）编码细胞毒素E的pVIII蛋白质；3）编码专一结合的pV蛋白质。
它们在噬菌体的组成和结构上有不同的作用。
其中，pIII和pVIII蛋白质被广泛地应用于蛋白质展示，pV 蛋白质则被用于病毒特异性分离。
噬菌体展示技术的基本步骤为：首先，在噬菌体pIII或pVIII蛋白质基因的外侧区域中插入目的蛋白的DNA序列；然后使用这些噬菌体感染大肠杆菌。
噬菌体在感染过程中就会将目的蛋白展示在其表面。
最后，可使用具有亲和力的配体或抗体选择目的蛋白并纯化。
二、优缺点噬菌体展示技术的优点主要集中在以下几个方面：1）大容量：噬菌体可以在感染过程中表达众多的外表面蛋白，其中每个蛋白均可成为一个展示物，针对多种噬菌体展示技术。
2）直接鉴定：在已知多肽的情况下，可以使用特定的抗体直接鉴定噬菌体表面的展示蛋白。
3）高灵敏度：噬菌体展示技术对目标蛋白的识别灵敏，并且可以使用大量病毒颗粒进行检测。
4）高效率：噬菌体展示技术可将展示蛋白直接表达在噬菌体的表面，无需进行分离提纯，从而加快了蛋白纯化过程。
噬菌体展示技术的缺点主要有以下几方面：1）分子大小限制：目前仅适用于直径小于1/3噬菌体直径的蛋白分子。
2）生物安全：组装成噬菌体后，展示蛋白无法及时得到更新，可能会导致噬菌体的生物安全风险。
3）抗原性：由于目的蛋白常常被表达在噬菌体的表面，因此它们可能会被视为异物而引起免疫反应。
三、应用由于噬菌体表面蛋白质的展示，噬菌体展示技术已经被广泛应用于生物医学研究和工业生产中。
噬菌体展示技术的原理和方法
噬菌体展示技术的原理和方法噬菌体展示技术是一种利用噬菌体表面展示特定肽段或蛋白的技术。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已在许多领域显示出广阔的应用前景，包括药物研发、疫苗设计、蛋白质相互作用研究等。
本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理和方法，并探讨其优缺点和发展趋势。
噬菌体展示技术利用的是噬菌体的特性，噬菌体是一种病毒，专门感染细菌等微生物。
它们由蛋白质外壳和内部遗传物质组成，其中蛋白质外壳又由多个蛋白亚基组成。
噬菌体展示技术利用噬菌体表面展示特定的肽段或蛋白，这些肽段或蛋白可以来自天然蛋白质，也可以是人工合成的。
展示在噬菌体表面的这些肽段或蛋白能够与特异性受体结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示技术的关键之一是选择合适的展示载体。
载体通常是一种丝状噬菌体，其基因组可以容纳较小的外源基因片段。
常用的载体包括M filamentous phage等。
这些载体具有一些共同的特性，如对外源蛋白质的容纳能力较强，能在体内和体外环境中稳定存在等。
在噬菌体展示技术中，需要筛选出能感染特定细菌的噬菌体。
这些噬菌体可以是自生的，也可以是通过基因工程改造得到的。
在筛选过程中，可以利用不同细菌的特性，如受体类型、细胞壁结构等，来选择合适的噬菌体。
还需要考虑噬菌体的毒性、繁殖能力等因素。
在噬菌体展示过程中，需要反复感染以积累足够数量的展示肽段或蛋白。
这个过程中，通常需要使用超滤或凝胶过滤等手段对噬菌体进行纯化，以确保得到的展示肽段或蛋白的纯度和浓度。
反复感染的过程不仅可以增加展示肽段或蛋白的数量，还能帮助排除展示过程中可能产生的突变。
克隆选择是噬菌体展示技术的另一个关键步骤。
这个过程中，通过将展示肽段或蛋白与特定配体结合，筛选出能够与配体结合的克隆。
这些克隆可以进一步扩增和纯化，从而获得高亲和力和高特异性的克隆。
噬菌体展示技术的优点在于其能够将蛋白质或多肽特异性与噬菌体的生物学特性相结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示技术的原理及应用
噬菌体展示技术的原理及应用引言：噬菌体展示技术是一种基因工程手段，在生物医学领域得到广泛应用。
它通过利用噬菌体作为载体，将目标蛋白质展示在噬菌体表面，从而实现了某种特定蛋白的高效筛选和研究。
本文将从噬菌体展示技术的原理及应用两个方面进行详细介绍。
第一部分：噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术的核心在于将目标蛋白质与噬菌体连接并展示在噬菌体表面。
这一步骤通常通过融合目标蛋白和噬菌体外壳蛋白的方式实现。
噬菌体外壳蛋白通常包括毒素结合蛋白（pIII）和胶原结合蛋白（pVIII）两种类型。
首先，将目标蛋白的编码序列与噬菌体外壳蛋白的编码序列相连，形成融合蛋白序列。
然后，将融合蛋白序列插入噬菌体基因组中，使其能够在噬菌体感染细胞后被表达。
最后，经过一系列筛选步骤，选择能够正确展示目标蛋白的噬菌体克隆，得到可以继续研究的目标蛋白样品。
噬菌体展示技术的原理其实比较简单，但是其应用范围非常广泛。
接下来，我们将针对几个典型的应用场景进行分析。
第二部分：噬菌体展示技术在药物研发中的应用噬菌体展示技术在药物研发中具有很大的潜力。
通过这一技术，可以筛选出具有特定功能的抗体或蛋白，用于研发新药。
例如，通过对癌细胞表面的特定蛋白进行展示，可以筛选出能够靶向癌细胞的药物。
这种药物在治疗癌症方面具有很大的潜力。
此外，噬菌体展示技术还可以用于筛选其他类型的药物靶点。
例如，许多感染性疾病的病原体表面都存在特定的蛋白结构。
通过将这些蛋白展示在噬菌体表面，可以通过筛选获得能够靶向这些病原体的药物靶点，为抗感染药物的研发提供重要的依据。
第三部分：噬菌体展示技术在生物工程中的应用除了在药物研发领域，噬菌体展示技术还在生物工程领域发挥着重要的作用。
在生物工程中，噬菌体展示技术可以用于筛选和改造特定酶。
通过将目标酶展示在噬菌体表面，可以利用大规模筛选技术快速获得具有特定催化性能的酶。
此外，噬菌体展示技术还可以用于疫苗研发和抗体工程。
通过将疫苗候选抗原或抗体展示在噬菌体表面，可以大大提高其免疫原性和特异性。
噬菌体展示技术的原理及应用
噬菌体展示技术的原理及应用将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合（插入信号肽与衣壳蛋白基因间）后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，每个噬菌体只含1个外源基因，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面。
导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。
当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库（展示文库为流动相，被筛蛋白为固定相）时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，从而分离出展示库里的某个特定的噬菌体，研究该噬菌体所含外源基因的生物学功能。
技术发展噬菌体展示优越性1、将蛋白与其遗传信息之间提供了直接的物理联系，可有效的对所需功能的克隆进行反复筛选并扩增。
2、被展示多肽或蛋白结构功能与天然状态接近，可简便快速筛选得到与靶分子高亲和力的被展示物。
3、筛选过程中，特定的噬菌体克隆由于对其配体的特意亲和性而不断的得到富集，从而使相对稀少的可以结合配体的克隆能够快速、有效地从一个大文库中被筛选出来。
4、与其它技术相比，容易对库容量较大的文库进行筛选。
噬菌体展示局限性：1、肽库容量受大肠杆菌转化效率影响，容量一般在109，高于此限制的较多基因将难以表达；2、编码多肽的基因带有一定的密码子偏爱性，限制了肽库的复杂度；3、噬菌体宿主大肠杆菌的生物合成系统有自身的限制因素，如缺乏氨基酸修饰、蛋白糖基化、不能合成D型氨基酸。
4、在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就限制了所建库的分子多样性。
5、不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。
应用范围肿瘤研究及药物靶向治疗诊断用疫苗研发酶抑制剂筛选构建抗体/cDNA文库研究蛋白质与核酸相互作用的生物学过程研究新型的基因导向系统Eg1：从HBx（肝癌相关抗原）单抗细胞中克隆重链可变区基因，重组入M13噬菌体，验证表达产物具有活性，然后表达出单链抗体、单域抗体或嵌合抗体，为肝癌导向治疗研究提供基础。
噬菌体展示
噬菌体展示
简介
噬菌体是一种能够感染细菌并在其中繁殖的病毒。
它被广泛用于生物学研究和生物技术应用中，特别是在基因工程和基因治疗领域。
噬菌体展示技术是一种将特定蛋白质或肽段展示在噬菌体表面的方法。
通过选择与目标蛋白质相互作用的噬菌体克隆，可以筛选出具有特定功能的蛋白质或肽段。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、应用和优点。
原理
噬菌体展示技术依赖于噬菌体基因组中的一个外源基因，该基因编码目标蛋白质或肽段。
这个外源基因通常被插入到噬菌体的毒力因子基因中，例如毒力因子III基因。
插入后，目标蛋白质或肽段会与细菌细胞的表面结合。
噬菌体携带的基因信息会导致细菌细胞表面展示目标蛋白质或肽段。
通过这种方式，科研人员可以通过筛选和选择的方法找到与目标蛋白质或肽段相互作用的噬菌体克隆。
应用
噬菌体展示技术在生物学研究和生物技术应用中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：
抗体库筛选
噬菌体展示技术可用于抗体库筛选，以寻找与特定抗原相互作用的抗体。
通过将抗原展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出具有高亲和力和特异性的抗体，用于治疗和诊断应用。
肽库筛选
噬菌体展示技术也可用于肽库筛选，以寻找具有特定功能的肽段。
通过将肽段展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出与特定靶点相互作用的肽段，用于药物开发和治疗应用。
蛋白质互作网络研究
噬菌体展示技术可以用于研究蛋白质互作网络。
通过将一种蛋白质展示在噬菌体表面，并将其用作识别其他与其相互作用的蛋白质的。
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噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。
1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。
1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。
这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。
传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。
此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。
而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。
根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。
近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。
通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。
这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。
1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。
在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。
1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。
1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。
1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。
这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。
2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。
2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。
它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。
丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。
噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。
因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。
噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。
2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。
2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。
由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。
3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。
将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。
用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直接吸附于酶标板,也可固定在生物小磁珠上,或者把经生物素化靶分子固定在包被链霉亲和素的ELISA小孔或生物磁珠上(利用链霉亲和素与生物素的高亲和力)。
而对于无法提纯或靶分子(如抗原)性质不确定的情况,如癌细胞的表面受体,需建立相应的筛选系统如双层膜筛选系统:第一种膜为亲水性膜,第二种膜为疏水性膜,膜表面包被目标蛋白,细胞先在第一种膜上培养,然后移至第二层膜,分泌的可溶性蛋白可透过第一层膜,与第二层膜上的目标蛋白结合,再用已知配体筛选。
3.2选择感染性噬菌体(SIP):用特定的多肽或蛋白替代P 蛋白使噬菌体丧失感染能力,再通过这些多肽或蛋白与其配基的结合恢复感染能力。
此方法将蛋白质配基间的相互作用与噬菌体的感染扩增直接联系[6],能使特异性筛选和噬菌体扩增同时进行。
筛选蛋白或配基无需表达和纯化,只需DNA存在,少量的功能产物表达即可筛选,但缺点是筛选效率受到SIP文库的有效库容的限制。
3.3延迟感染性筛选:由Benhar于2000年建立[7]。
利用细菌表面展示系统中细菌外膜蛋白A(Lpp-Ompa)的多用性特点,将目标蛋白的编码序列融合到杂交的外膜蛋白A来展示[8]。
当噬菌体被捕获或淘洗后,细菌被转入37℃培养,噬菌体因F纤毛得到表达而重新具有感染能力,成为被选克隆。
此法筛选的进程与常规先选择再感染的过程相反,即被选择的细菌才可被捕获的噬菌体感染,所以又称“反向筛选”。
其优点是:筛选所需目标蛋白的浓度很低,比常规方法低103,适合于大文库中有效筛选稀有克隆。
4噬菌体肽库的构建和多肽的进化由于电转化效率的限制,在随机氨基酸数目大于7时,构建的文库很难容纳所有可能的多肽。
因此,从噬菌体展示文库中筛选到的随机多肽还需要进一步的改造,以提高其结合力或专一性。
这一步可以通过以下方法实现:(1)定点突变:Sharon等采用体外定点突变的方法对低亲和力抗体Vh中的一些氨基酸逐个突变,发现三个不同位置的三种氨基酸具有较高亲和力,将这三种氨基酸组合在一起,结果使抗体亲和力提高了200倍。
(2)在致突变株进行体内突变:大肠杆菌MutD5株DNA聚合酶全酶中ε亚基基因MutD一旦发生突变,就丧失了校正功能,在复制时体内基因突变率明显增加。
该菌株的Lac 基因易发生单个突变,其自然突变率比野生型株高100倍。
该株的高突变率可用于抗体V区的基因突变,以改善噬菌体的亲和力。
Low等采用此方法进行噬菌体抗体的亲和力成熟[9]。
(3)错误倾向的PCR:Winter等利用错倾PCR方法引入突变使亲和力提高。
在抗体库中还可以采用以下方法:(1)CDR的突变(walkingmutagenesis):随机合成的CDR区作为引物,通过PCR,特定位点上可发生变化,从而可建立次级突变库。
(2)链更替(chainshuffling):将得到的低亲和力噬菌体肽或抗体的一条链(如轻链)与另一条链(如重链)的全部组合得到次级库,选择亲和力改善的克隆,再次重链固定,与轻链全部组合建库,筛选高亲和力的克隆。
目前可供筛选的噬菌体肽库以线性肽库为主,构象具可变性,在一定程度上,虽可以增加筛选到与特定靶分子特异性结合的配体的可能性,但同时也因结合时的损失较大,难以筛选到高亲和力的结合配体。
针对这一现象,目前采取的策略有:(1)通过对展示肽库的限制来获得高亲和力的克隆,如:将线性肽两端引入半胱氨酸形成环肽,将肽链折叠时取向固定。
(2)预先设计分子构架,构建构象性肽库。
这是一种基于骨架蛋白基础上的噬菌体肽库技术。
以结构稳定的小分子α-螺旋和β-片层构成的分子支架为基础,改造分子表面连接α-螺旋和β-片层的转角、环形区或一些无规则的肽段。
改造的方法可以是其中某些肽段随机化,也可以将其它蛋白和多肽中的活性有关序列插入其间[10]。
目前最常见的是以天然抗体为结构骨架建立的噬菌体抗体库,主要是β-片层结构。
抗体分子经长期进化所产生的基因结构重排,可使抗体库获得的多样性达107以上,也可以通过人工设计改造建立人工抗体库。
5噬菌体展示技术的应用噬菌体展示肽库技术作为研究生物分子间相互作用快捷而有效的工具,广泛适用于抗原抗体系统、细胞因子与受体的作用及酶学等领域,筛选的靶物质包括抗体、酶、受体及其他功能蛋白,或者细胞、血清乃至整个动物。
5.1以单克隆抗体模拟抗原表位:以纯化的单抗为靶分子筛选抗原模拟表位是噬菌体展示技术应用最广泛的方面。
目前,利用肽库已成功地筛选多种病毒的抗原表位,如HCV核心抗原表位[11]、HIVgp120蛋白的表位[12]。
用抗单纯疱疹病毒型(HSV-1)的mAb筛选12肽库,得到HSV-1糖蛋白gC的模拟肽[13]。
王军俭[14]等以抗bFGF单克隆抗体CF22为目标蛋白,采用梯度洗脱,从七肽库中筛选到能特异性抑制bFGF结合到CF22的阳性克隆,经检测序列有高度保守性,且用此小肽免疫小鼠能诱导抗bFGF抗体的产生,其免疫反应阳性率与bFGF非常接近,在寻找抗bFGF肿瘤疫苗上有潜在价值。
杨琨等[15]在确定能阻断PTA1-Fe 融合蛋白与其天然配体结合mAb(LeoA1)的基础上筛选12肽库,得到多个能与LeoA1特异性结合的短肽,这些短肽有较保守而集中的模式序列WP/HXH/TH/C,有可能模拟PTA1分子的功能表位,成为其天然配体的拮抗剂,这为进一步揭开PTA1分子及配体在各种生理和病理状态中可能起的作用及寻找PTA1配体提供有价值的依据。
5.2模拟细胞因子受体等其他分子的表位:采用其他纯化蛋白、细胞因子或膜蛋白等也能筛选到与之结合的噬菌体展示肽。
如用可溶性TNF受体蛋白(sTNFRI)可以筛选模拟TM-TNF-α核心表位。
叶飞[16]等用12肽库筛选到分别能模拟s-TNF-α和TM-TNF-α的噬菌体克隆,序列分析分别获得TM-TNF-α和s-TNF-α细胞毒效应的保守序列。
这两种保守序列既有相关性,又有明显区别,提示两型TNF-α与TNF受体结合位点可能不同,从而引发TNF受体下游的传导信号通路不同。
而且这两个保守序列与TNF-αcDNA序列无同源性,这种与模拟蛋白一级结构的不符表明噬菌体表面的实际序列为构象表位而不是线形表位。
用TM-TNF-α的保守序列合成多肽观察其生物学活性,实验表明该肽段不仅对HL-60细胞具有明显的细胞毒反应,呈剂量依赖性,且主要导致靶细胞凋亡。