噬菌体展示肽库说明书
噬菌体展示技术和其应用ppt课件
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应用举例：
部分做过的工作
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
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34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
诺安净噬菌体说明书
诺安净噬菌体说明书诺安净噬菌体说明书诺安净噬菌体是一种高效的抗菌剂，广泛应用于医疗、农业和食品工业等领域。
本说明书将详细介绍诺安净噬菌体的特性、用途和使用方法，以帮助用户正确使用该产品。
一、产品特性\n1. 高效杀菌：诺安净噬菌体具有高度选择性，能够迅速杀灭多种细菌，包括耐药菌株。
\n2. 安全环保：诺安净噬菌体对人体无毒副作用，不会对环境造成污染。
\n3. 广谱抗菌：诺安净噬菌体能够有效抑制多种病原微生物的生长和繁殖。
\n4. 长效稳定：诺安净噬菌体具有较长的存活期，能够持久地发挥抗菌作用。
二、主要用途\n1. 医疗领域：诺安净噬菌体可应用于医院、卫生院等医疗机构的消毒和杀菌工作。
它可以有效地杀灭空气中的细菌和病毒，保障患者和医护人员的健康安全。
\n2. 农业领域：诺安净噬菌体可用于农作物的病虫害防治。
它能够杀灭多种农作物病原菌，提高农作物的产量和质量。
\n3. 食品工业：诺安净噬菌体可应用于食品加工过程中的卫生保洁工作。
它能够有效地杀灭食品中的细菌和霉菌，延长食品的保质期。
三、使用方法\n1. 医疗领域：将适量的诺安净噬菌体溶解在适量的生理盐水中，使用喷雾器或雾化器将其喷洒在空气中，或直接涂抹在物体表面。
\n2. 农业领域：将适量的诺安净噬菌体溶解在适量的水中，使用喷雾器均匀喷洒在植物叶面上。
\n3. 食品工业：将适量的诺安净噬菌体溶解在适量的清水中，使用喷雾器均匀喷洒在食品表面。
四、注意事项\n1. 使用前请仔细阅读本说明书，并按照说明进行操作。
\n2. 使用过程中请佩戴防护手套和口罩，避免直接接触诺安净噬菌体。
\n3. 使用后请及时清洗工具和容器，避免交叉感染。
\n4. 请妥善保存诺安净噬菌体，避免阳光直射和高温环境。
总结：诺安净噬菌体是一种高效、安全、环保的抗菌剂，广泛应用于医疗、农业和食品工业等领域。
正确使用该产品可以有效地杀灭细菌和病毒，保障人们的健康安全。
希望本说明书能够帮助用户正确使用诺安净噬菌体，发挥其最大的功效。
噬菌体展示及酵母展示
• PVIII是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于 噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬 菌体外，每个病毒颗粒有2700个左右PVIII 拷贝。 • 由于PVIll分子较小，只能融合较小的外源 肽段。但优点在于它的拷贝数多，因此该 系统一般用于筛选亲和力较低的配体，在 疫苗开发上具有潜在的应用价值。
酵母细胞壁结构
• 酿酒酵母的细胞壁非常坚硬，主要由位于 细胞膜外的甘露糖蛋白和β-葡聚糖组成。 • 细胞壁具有双层结构，内层是由β- 1，3-葡 聚糖和β- 1，6-葡聚糖连接形成的骨架，外 层是主要由甘露糖蛋白组成的纤维状或毛 刷状的结构。
锚定方式
• 作为锚定蛋白的细胞壁甘露糖蛋白主要存 在两种类型： • 一种与细胞壁非共价松弛连接，可被SDS 抽提； • 另一种与细胞壁共价相连，可用β- 1，3一 或β- 1，6葡聚糖酶消化细胞壁释放出来， 但不能被SDS（十二烷基硫酸钠）抽提。
• 由于酵母展示的蛋白质是紧密锚固在细胞壁上， 可以耐受SDS等的抽提,同时酵母有发酵特性，生 长快，因此在工业上具有很好的应用前景. • 例如，将不同特异的金属结合蛋白表达在酵母表 面，产生的环境进化微生物，可用于废水处理中 吸附金属离子和放射性物质.
• 将具有催化活性的酶固定在酵母细胞壁上，可防 止酶的不可逆抑制，再生酶的活性.
Байду номын сангаас
同时用c-myc（原癌基因）单抗和荧光 素偶联的dextran(葡聚糖）(FITCdextran)标记的细胞可用激光扫描共聚 焦显微镜检测。
• 絮凝素FlolP富含N-和O糖苷连接而形成杆 状构象,在细胞表面的絮凝反应中起着主要 作用。 • Flolp絮凝功能结构域靠近N端，识别细胞壁 中的A甘露聚糖组分并与之非共价结合，引 起细胞聚集成可逆性絮状物。
噬菌体随机肽库_中文说明书_phage_display
目录简介 (2)培养基和溶液 (5)常规M13方法 (6)淘选程序（固定靶分子） (8)结合克隆的特征 (12)其他淘选方法（液相结合法） (15)其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16)附录：优化肽结合相互作用 (19)文库的氨基酸分布 (21)试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）：•随机十二肽噬菌体展示文库100 µl, 1.5×1013 pfu/ml。
贮存于含50%甘油的TBS溶液中。
复杂度~2.7×109个转化子。
•-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/µl •-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/µl, 1 pmol/µl •E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。
该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。
贮存于-70℃。
•链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg•生物素，10 mM 100 µl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。
概述噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。
噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。
M13噬菌体
M13噬菌体M13 phage一种丝状噬菌体，可感染含F因子的大肠杆菌细胞。
遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。
M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。
但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失活插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。
其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。
它是一种质粒载体。
M13噬菌体在感染雄性大肠杆菌（F+或Hfr）时，都是以一端吸附在F型菌毛的顶端，所以称为F特异性丝状噬菌体。
而对雌性大肠杆菌（F-）不敏感。
所以Hfr型的大肠杆菌和携带F'质粒的大肠杆菌都能被感染相关应用配置：M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒相关例子：兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备，M13噬菌体已被广泛地应用于噬菌体展示技术。
M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂。
我们制备了兔抗M13抗血清,其效价高于1:6000;经两步饱和硫酸铵沉淀,初步纯化了兔抗M13抗体;用过碘酸钠法对抗体进行了辣根过氧化酶的标记,酶标记抗体活性为1:6400。
噬菌体释放方式：M13噬菌体溶源性，不裂解宿主菌。
极大地简化了每轮淘选过程中的噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法即可。
融合方式：M13噬菌体N端与pIII蛋白融合，不适合克隆cDNA，因为cDNA中为oligo d(T))常位于翻译终止密码子的下游。
融合序列大小：M13噬菌体展示肽库为7肽、12肽和环7肽NEBM13噬菌体展示肽库可用于定位抗原决定簇，确定蛋白质相互作用位点，鉴定酶的底物或抑制物，鉴定受体激活物或抑制剂，研制多肽药物，开发新药，肿瘤治疗和疫苗制造，用途广泛M13噬菌体感染雄性大肠杆菌需要完整的F菌毛，通过F因子编码的性菌毛进入宿主细胞内，如果噬菌体DNA通过感染导入细菌，那么也可以感染雌性大肠杆菌，但是通过转染产生的子代颗粒不能感染培养基中的其他细菌，所以病毒的产量很少单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备：这个方案主要用于制备大量M13噬菌体的双链DNA，因在实验室中M13噬菌体经常被用作克隆载体，以及在某些特殊用途时需要制备大量的单链噬菌体DNA，如当一个特定的重组体被多次用于制备反射性标记探针或构建大量定点突变体时。
《噬菌体展示技术》PPT课件
精选课件
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pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
精选课件
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噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
精选课件
15
噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合
Bind to Streptavidin coated magnetic bead
精选课件
13
筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法：
直接将靶分子包被在固相表面
优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入
可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法：
将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体 复合物。
优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
• N2 受体结合区：负责结合F菌毛。
• CT 疏水区：组装前黏附在细菌内 膜上；与噬菌体组装终止有关。
• G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程 中，增加各个功能域之间的灵活性
精选课件
7
主要外壳蛋白 pVIII
• 每子个病毒含约2700个拷贝， 约10%能有效地融合外源多 肽。以pIII融合子方式表达的 是单价的，而以pVIII融合子 方式表达的则是多价的。
噬菌体培养试剂盒产品说明书(中文版)主要用途
用转导。
产品内容
培养液（Reagent A） 裂解液（Reagent B） 稀释液（Reagent C） 固养液（Reagent D） 胶顶液（Reagent E） 产品说明有 固养液（Reagent D）的 90mm 直径的细菌培养板，确保铺满整个表面
放进 37℃培养箱孵育 16 小时：可见透亮区域的为噬菌斑
放进 4℃冰箱里
计数噬菌斑
计算噬菌体原液和繁殖效价以及噬菌体感染复数（multiplicity of infection；MOI）
噬菌体效价（PFU/毫升）＝
1
台式离心机：用于沉淀细胞或残渣
实验步骤
一、 噬菌体繁殖
1、 移取 xx 毫升 培养液（Reagent A）到无菌的 125 毫升三角烧瓶 2、 加入 100 微升用户自备的过夜新鲜培养的敏感宿主细菌（例如 1 X 108/毫升） 3、 放进 37℃摇床孵育 1 小时，速度为 220RPM 4、 加入 100 微升用户自备的P1 噬菌体，总量为 5 X 109 5、 放进 37℃摇床孵育 2 小时，速度为 220RPM，或可见明显的细胞溶解 6、 转移上述培养噬菌体到新的无菌的 15 毫升锥形离心管 7、 加入 xx 毫升 裂解液（Reagent B） 8、 盖上盖子，上下反复倾倒混匀 30 秒 9、 放进台式离心机离心 15 分钟，速度为 10000g 10、移取上清液相到新的无菌的 15 毫升锥形离心管 11、加入 xx 微升 裂解液（Reagent B） 12、即刻放进 4℃冰箱里保存 13、或即刻进行各种后续操作
2
管号 1 2 3 4 5 6 7
噬菌体展示技术操作步骤
筛选多肽试剂及配制（1）LB培养基：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 5g溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。
（2）IPTG/Xgal：称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。
（3）LB/IPTG/Xgal平板：1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。
（4）顶层琼脂糖凝胶：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 5gMgCl2.6H2O 1g琼脂糖7g溶于适量去离子水中，至总体积为1L。
高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。
（5）2×M9盐：Na2HPO412gKH2PO46gNaCl 1gNH4Cl 2g溶于适量去离子水中，至终体积为1L。
（6）小型平板：500ml 2×M9盐500ml 3%琼脂粉20ml 20%葡萄糖2ml 1M MgSO40.1ml 1M CaCl21ml 硫胺素（10mg/ml）在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。
平板储存于4℃。
（7）封闭缓冲液：0.1M NaHCO3(PH 8.6)5mg/ml BSA0.02% NaN3过滤除菌，储存于4℃。
（8）TBS：50mM Tris-HCl (PH 7.5)150mM NaCl高压灭菌，室温储存。
（9）PEG/NaCl：20%（w/v）聚乙二醇-80002.5M NaCl高压灭菌，室温储存。
（10）碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl (PH 8.0)1mM EDTA4M NaI室温避光保存。
操作步骤：1．第一天（1）以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备 100μg/ml的靶分子溶液。
如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。
（2）在每孔内加入1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。
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-96 gIII sequencing primer 5´- HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3´, 100 pmol, 1 pmol/µl
-28 gIII sequencing primer 5´- HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C –3´, 100 pmol, 1 pmol/µl
Introduction
Phage display describes a selection technique in which a library of peptide or protein variants is expressed on the outside of a phage virion, while the genetic material encoding each variant resides on the inside (1-3). This creates a physical linkage between each variant protein sequence and the DNA encoding it, which allows rapid partitioning based on binding affinity to a given target molecule (antibodies, enzymes, cell-surface receptors, etc.) by an in vitro selection process called panning (4). In its simplest form, panning is carried out by incubating a library of phage-displayed peptides on a plate (or bead) coated with the target, washing away the unbound phage, and eluting the specifically bound phage (Figure 1). The eluted phage are then amplified and taken through additional binding/amplification cycles to enrich the pool in favor of binding sequences. After 3–4 rounds, individual clones are characterized by DNA sequencing and ELISA.
Protein TOOLS
Ph.D.™ Phage Display Libraries
Instruction Manual
NEB #E8100S, #E8101S, #E8102L, #E8110S, #E8111L, #E8120S, #E8121L Store at –20°C
Ph.D.™ Phage Display Libraries
Streptavidin, lyophilized 1.5 mg
Biotin, 10 mM 100 µl
Ph.D. Peptide Display Cloning System (Supplied with E8101 only) 20 µg M13KE glll Cloning Vector, 2150 pmol Extension Primer
Protocol 1: Surface Panning Procedure (Direct Target Coating) . . . . . . . . . 14 Protocol 2: Solution-phase Panning with a Biotinylated Target and Streptavidin Plate Capture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 Protocol 3: Solution-phase Panning with Affinity Bead Capture . . . . . . . . . . 19 Post Panning Protocols Plaque Amplification for ELISA or Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Sequencing of Phage DNA Rapid Purification of Sequencing Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Phage ELISA Binding Assay with Direct Target Coating . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Use of Synthetic Peptides in Specificity Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Expression of Selected Sequences as Monovalent MBP Fusions . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Appendix: Optimizing Peptide Binding Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Choice of Library . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Selection of Cell-Specific Peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Ordering Information . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1
Kit Components
All kit components should be stored at –20°C except where noted:
Phage Display Peptide Library 100 µl, ~ 1 x 1013 pfu/ml. Supplied in TBS with 50% glycerol.
Table of Contents:
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Media and Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 General M13 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Construction of pIII-Display Libraries using M13KE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Panning Protocols