光合细菌分类、鉴定及保存
光合细菌菌种的分离、富集培养、纯化和菌种鉴定及净化水质的研究
１ ３ １ 光合 细菌 富集 富集 和分 离 不 同类 型 的光 合 ． ． 细菌 所用 培养 方 法 不完 全 相 同 。 首先 ， ５ １ ０ 生 取 ０ ０克 长 光合 细菌 的土壤 ， 灭菌 后装 入 玻璃 量筒 内 ， 再加 入采 集 的样 品水 。 根据 欲要 分 离 的不 同光合 细菌 选 用上 述相 同的培 养 基 １０～ ０ ０ ２ ０毫 升 ， 并与 土壤 搅 拌 均匀 ， 后加 流体 然 石蜡 隔绝 空气 ， 成 厌氧 的环 境 。 造 在 ２ ３ ℃ 温 度下 ，用 ５０ ０ １ ０ ５— ５ ０ ００ ０勒 克斯 的 光 照强度 进 行光 照 培养 ２—８周 （ 活在海 水 中的菌株 生 生 长较缓 慢 ， 要 培养 １—３ 月 ） 需 个 。这 时 ， 合 细菌在 光
配法 同富集 培养 基 ， 加 入 Ｎ Ｈ Ｏ 的量 为 ２克 ／ 但 ａＣ ａ
５ ０毫 升 ， ｐ 调 Ｈ值 到 ７ ０后 ， 入 Ｎ ９ ： ． ． 加 ａＳ・ Ｈ ０ １０克
５ ０毫 升水 ， １千克 ／ 米 灭菌 １ 钟 ， 厘 ５分 以便 降低 培养 基 的氧 化 还原 值 。酒 精 或戌 醇 或 ４ ％丙 氨 酸 的用 量 同 富 集培养 基 。
・
形 态基 本 一致 ， 纯化 工作 才 结束 。菌 株做 鉴 定备 用 。
１４ 光合 细菌 的 菌种鉴 定 ． 以 《 明第 八 版伯 杰 细菌 鉴定 》… 为 主要鉴 定 手 简
册 同时 ， 照 《 参 细菌 学 概论 》 ， … 进行 菌种 鉴定 。
１５ 净化 水质 技 术 的研 究 ． 按 污 水 体 积 １ 的量 加 人 人 工 培养 的光 合 ０ｘ１ ０ 细菌培 养液 （ ０， 毫升 以上 ） ３ ｆ Ｌ／ 。每 隔 １ 投放 １ ， ０天 次 共投 放 ４次 ， ４ 即 ０天 为一个 处 理 周期 。
光合细菌培养基操作说明
一、用途：本品用于培养光合细菌（PSB）
二、性状：枯黄色糊状、粉状或块状物体，带醋味，无毒。
三、含量：净重300+5克，可培养出50千克成品菌液（浓度为每毫升30亿个活菌体以上）。
四、主要成份：碳、氢、氧、氮、磷、钾。
五、执行标准：Q/321081BJA001-2009
六、用法：取本品一袋溶于50千克清洁的淡水或海水中，加入10千克以上PSB菌种（优质成品菌），制成培养液；将培养基放于阳光下，保持温度30℃左右，约10天即可达到成品菌浓度，成为成品菌，可将此再作菌种，继续培养扩大。
培养容器应为白色或透明容器。
七、保存：本品宜存放于阴凉避光处，不能存放于高温和强光照射的环境中。
八、保存期：包装完好并且符合第七项要求时，本品可长期保存。
高产辅酶Q10光合细菌的筛选及鉴定-2019年文档资料
高产辅酶Q10光合细菌的筛选及鉴定光合细菌（Photosynthetic bacteria，PSB）是一大类能利用光能作为能源进行不放氧光合作用的原核生物的总称，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，除蓝细菌外，都能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用有机物作氢供体兼作碳源，进行不放氧的光合作用以合成自身物质[1]。
光合细菌广泛分布在海洋、湖泊、江河、水田和活性污泥等各个角落，能充分利用光能和各种有机物为其营养源进行自身的营养繁殖[2]。
光合细菌营养丰富，细胞干物质中蛋白质含量超过60%，含有多种维生素，尤其是B族维生素含量极为丰富，VB12、叶酸、泛酸、生物素的含量远高于酵母[3]，在人类生活的多方面都具有极其重要的作用。
光合细菌中辅酶Q10（CoQ10）的产量较高，尤其是红螺菌科细菌。
Yoshida等[4]报道了用Rhodobacter sphaeroides KY - 4113生产CoQ10。
目前日本已实现利用光合细菌工业化发酵生产CoQ10，而国内应用光合细菌发酵生产的技术还未成熟，主要还是用来净化水体、作为生物肥料以及动物饲料添加剂[5～7]。
CoQ10又称泛醌，是一种脂溶性醌类化合物，主要存在于动植物和微生物体内，在细胞内与线粒体内膜结合，作为生物体内细胞呼吸链上的电子递氢体和能量代谢的激活剂，是人体重要的生化辅酶之一。
CoQ10在心血管疾病的治疗中起重要作用，并可提高人体免疫力和治疗人体免疫系统疾病，是一种临床价值很高的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗[8，9]。
因此，筛选高产CoQ10的光合细菌具有积极的现实意义。
我们利用富集培养基从池塘污泥中富集和分离出5株光合细菌，对这5株光合细菌产生的CoQ10进行了定性定量分析，并对CoQ10产量最高的菌株进行了表型特征、生理生化特性及16S rDNA的系统发育分析，为以后提高CoQ10产量提供菌株材料。
光合细菌菌种分离与保藏
光合细菌菌种分离与保藏随着健康养殖渔业的发展，光合细菌越来越受到养殖者的青睐。
光合细菌广泛分布于生物圈的各个角落，在净化水质、防治疾病和促生长方面效果明显，可作为鱼、虾、贝的饵料、饵料添加剂及浮游动物饵料。
光合细菌的培养首先要有菌种，菌种是从它生活环境中的微生物群中分离出来的。
笔者现以水产养殖和水质净化中常用的红螺菌种为例，简单介绍其分离和保藏技术，以供生产者参考。
菌种的分离采样红螺菌种的种类在自然界中有有机污染的地方广泛存在。
样品可以从河底、湖底、海底以及水田、池塘、沟渠等有污水进入的地方，以及食品工业污水排放处的橙黄色、粉红色泥土中获得。
可以用杯子采集少量泥土，连水放入广口瓶或用采水器、采泥器取样。
为了获得密度较高的样品，也可以采取淡水池塘、池沼及海边的污泥，置入广口瓶中盖紧，分别加入几片海带或其它一些海藻，装满淡水或海水，置入日光下培养。
大约一个月以后，瓶底就可以见到光合细菌的沉淀物。
经过这样的简单培养后，可以直接对此菌作分离后进行纯培养。
富集富集培养时，将采集的样品装入玻璃圆筒或大型试管或具塞磨口玻璃瓶，再倒入配制好的培养液，充分搅拌。
为造成厌气环境，在玻璃瓶或试管中加入液体石蜡以隔绝空气；磨口瓶只需将培养液加满加塞，以排除其中空气，瓶外再用塑料薄膜裹住扎牢，以减少水分蒸发。
培养温度为5℃～35℃。
光照可以利用阳光，夜晚时则利用人工光源，光照强度的适宜范围为5000Lux～10000Lux。
在这样的培养条件下，大约经过2周～8周的培养，在玻璃瓶壁上会出现光合细菌的菌落，或者整个培养液长成红色。
如果是培养海水的光合细菌，因其生长缓慢，需要更长的富集培养时间。
富集操作可以重复进行，方法是将初步富集的光合细菌的菌液或泥土移入磨口玻璃瓶中继续培养，反复多次，光合细菌占绝对优势时可确认富集成功。
为了避免在培养液中藻类和绿杆菌科的细菌的发展，可采用滤光片，使波长800纳米或更长波长的光透过，这样可以更有效地达到富集紫色非硫细菌的目的。
一株光合细菌分离与初步鉴定
１ ．菌落及菌体形态观察 ．１ ５ 观察琼脂分离平板上生长 的菌落形态； 菌体 对 进行革兰氏染色 ， 显微镜下观察菌体形态并测定菌 体大 小 。 １ ． 细胞 吸收光谱 测定 ．２活 ５ 取 ５ Ｌ 体 培养 物经 ３０ ｒ ｎ 用 生理盐 水 洗 ｍ 液 ００／ ， ｍｉ 涤 两 次 ， 新 悬 浮 于 ６％的 蔗 糖 溶 液 中 ， 容 至 重 ０ 定 １ｍＬ 用 ６ ％的蔗 糖 溶 液作 为空 白对 照 ， 分 光 光 ０ ， ０ 用 度计 在波 长 ３０～８０ ｍ范 围测 定细 菌 的吸光值 ， ６ ４ｎ 绘 制吸 光度 曲线 。
２０ Ｌ ５ ｍ 三角瓶 中。加入液体富集培养基 ２０ Ｌ 与 ０ｍ ， 泥样振荡混匀 ， 液面注入０ ｅ 高灭菌液体石蜡 ， ．ｒ ５ａ 棉 塞 封 口 ， 成 厌 氧 环 境 。在 温 度 ２ ℃ 、 照 ５０１ 造 ８ 光 ００ ｘ 的生 化 培 养 箱 中培 养 至培 养 液 呈 红 棕 色 。移 取 红 棕 色光合 细菌 的富集 液 ｌ Ｌ至装有 富集 培养液 ５ ｍ ｍＬ 的试 管 中 ， 液面 注入 ０５ｍ高灭 菌液 体 石蜡 ， 持厌 ． ｃ 保 氧 条 件 。连 续 富集 ３ ， 欲要 分 离 的光 合 细 菌成 次 使
株光合细菌分离与初步鉴定水
董艳珍 ， 陈碧 华 ， 肖文 渊
（ 昌学 院 动 物科学 学 院 ， 西 四川 西 昌 ６５ １ ） １０ ３
【 摘 要 】 西 昌学院北校 区养 鱼池 的底泥 中富集分离得到 一株 光合细 菌， 从 该菌株 厌氧培养 物为红色， 兰氏染色呈 阴 革
性， 繁殖方式为二均分裂。通过形 态学观察及生理生化特性鉴定 ， 鉴定为该菌株属于红假 单胞 菌属 。
筛选光合细菌实验报告
一、实验目的1. 掌握光合细菌的分离筛选方法。
2. 熟悉光合细菌的形态特征和生理生化特性。
3. 提高微生物实验技能，培养严谨的科学态度。
二、实验原理光合细菌是一类在厌氧条件下进行光合作用的微生物，它们能利用无机物作为碳源和能源。
本实验通过平板划线法从土壤样品中分离筛选出光合细菌，并对其进行鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 土壤样品- 光合细菌培养基（PSB培养基）- 琼脂- 生理盐水- 氯化钠- 碳酸氢钠- 氯化钾- 磷酸氢二钠- 蛋白胨- 硫酸铵- 碘液- 75%酒精- 紫外灯- 恒温培养箱- 显微镜2. 实验仪器：- 高压蒸汽灭菌器- 烧杯- 玻璃棒- 离心机- 移液器- 平板划线器- 紫外线灯- 恒温培养箱四、实验步骤1. 准备PSB培养基：称取PSB培养基成分，加入适量蒸馏水，溶解后分装于锥形瓶中，121℃高压灭菌15分钟，待冷却后备用。
2. 制备土壤样品：取适量土壤样品，用生理盐水进行梯度稀释。
3. 制备平板：将PSB培养基倒入培养皿中，待凝固后，用无菌接种环取适量稀释后的土壤样品，在平板上进行划线。
4. 恒温培养：将平板置于恒温培养箱中，在适宜的光照条件下培养。
5. 观察与筛选：定期观察平板上的菌落，挑选具有明显特征的菌落进行进一步鉴定。
6. 鉴定：a. 观察菌落形态：记录菌落的颜色、大小、形状等特征。
b. 进行生理生化试验：包括氧化酶试验、糖发酵试验、淀粉酶试验等。
c. 染色观察：采用革兰氏染色法、芽孢染色法等方法，观察细菌的形态和结构。
五、实验结果与分析1. 分离筛选：从土壤样品中分离出多种菌落，其中一种菌落具有明显的绿色荧光，初步判断为光合细菌。
2. 鉴定结果：a. 菌落形态：该菌落呈圆形，直径约1-2mm，边缘整齐，颜色为绿色荧光。
b. 生理生化试验：氧化酶试验阳性，糖发酵试验阴性，淀粉酶试验阳性。
c. 染色观察：革兰氏染色为阴性，芽孢染色为阴性。
综合以上结果，初步鉴定该菌为光合细菌。
细菌鉴定手册（完整版）
细菌鉴定手册细菌鉴定手册[细菌鉴定手册]细菌鉴定手册一本有代表性的、参考价值极高、比较全面系统的细菌分类手册，细菌鉴定手册。
由美国布瑞德等人主编。
1923年第1版，后于1925、1930、 1934、1939、1948、1957、1974年相继出版了第2至第8版，每个版本都反映了当时细菌学发展的新成就。
其中第8版有美、英、德、法等 14个国家的细菌学家参加了编写工作，对系统内的每一属和种都做了较详细的属性描述。
近年来，由于细胞学、遗传学和分子生物学的渗透，大大促进了细菌分类学的发展，使分类系统与真正反映亲缘关系的自然体系日趋接近。
第9版(1984，1986)中实质性的变化，象征着细菌分类学的发展进入新的阶段。
第一，手册更名，原书名为《伯杰氏鉴定细菌学手册》，第9版由于内容增加，范围扩大，提高了手册的实用性，同时指出各类细菌间的关系，所以改名为《伯杰氏系统细菌学手册》;第二，由1卷分成4卷，这是考虑到能及时反映新进展和使用者的方便;第三，细菌在生物界的地位，8、9版间无变动，但它们的高级分类单位有很大变化，尤其嗜盐细菌和产甲烷细菌，根据胞壁分析和DNA序列分折，另列疵壁菌门，古细菌纲;第四，趋近自然体系，在各级分类单位中全面应用核酸研究;在表型特征的基础上，以DNA资料给予决定性的判断，鉴定材料《细菌鉴定手册》()。
使人为的分类体系过渡到自然体系的理想进一步付诸实现。
本书是在《一般细菌常用鉴定手册》一书的基础上编写而成的。
全书分两大部分:第一部分主要介绍了伯杰(Bergey)系统、常见细菌的检索表、属的提要及种的鉴别等;第二部分介绍了几种鉴定方法,包括常用的传统分类基本方法和目前通用的分子生物学方法及快速鉴定和自动化鉴定系统等。
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光合细菌(2)2+9h
５、光谱指标 光吸收植A660＞ 光吸收植A660＞1.5 A490＞ A490＞2.5 A805＞ A805＞1.7 A860＞ A860＞1.9 ６、卫生指标 沙门氏菌 黄曲霉素B1 黄曲霉素B1 (mg/Kg) 总砷（AS） 总砷（AS）( mg/Kg ) 铅 (mg/Kg)
无 ＜0.02 ＜0.5 ＜2.0
六、光合细菌在水Байду номын сангаас养殖中的应用
光合细菌由于菌体内含有丰富的蛋白质、氨 基酸、维生素B 基酸、维生素B族等，因此营养价值极高，可作为 主要的蛋白质饲料来源，为鱼、虾等所利用。同 时，由于光合细菌个体极小，是浮游生物的适饵， 而浮游生物又是稚鱼、虾类等的主要食物，因此 其在天然食物链中具有最佳的平衡作用。光合细 菌在自然水体中是生物的食物链和物质循环的中 心，对调节物质循环，能量流动，维持生态平衡， 净化水质起着极为重要的作用。
４、理化指标测定 （１）酸度测定 以不低于0.01PH值精度的酸度计，直接于20ml样 以不低于0.01PH值精度的酸度计，直接于20ml样 品中测量。 （２）电导率测定 以DOS－IIA型（或同等精度其它型号）电导仪直 DOS－IIA型（或同等精度其它型号）电导仪直 接于20ml样品中测量。 接于20ml样品中测量。 ５、光谱指标测定 取0.5ml样品置3ml容积，1cm光径比色杯中，加 0.5ml样品置3ml容积，1cm光径比色杯中，加 入2ml蒸馏水，以蒸馏水为对照，在可见分光光度 2ml蒸馏水，以蒸馏水为对照，在可见分光光度 计中读取660nm、490nm、805nm、860nm波长 计中读取660nm、490nm、805nm、860nm波长 处光吸收值，再乘5 处光吸收值，再乘5得到以上几个波长处的光吸收 值。 ６、卫生指标检验 （略）。
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红螺菌目（Rhodospirillales） 该目有2科7属。 红螺菌科（Rhodospirillaceae）6个属 醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）1个属 红细菌目（Rhodobacterales） 有1科4属 红细菌科， （ Rhodobacteraceae） 根瘤菌目（Rhizobiales） 有3科7属 慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）2个属 生丝微菌科（Hyphomicrobiaceae）3个属 红游动菌科（Rhodobiaceae）2个属
红螺菌目
红螺菌科 外硫红螺菌科 绿硫菌科 绿色丝状细菌
《伯杰氏系统细菌学手册》
近年的分子系统学研究表明， 近年的分子系统学研究表明，紫色非硫细菌的系统发育 是多起源的，分散在变形菌门α和 两个纲的多个科中 两个纲的多个科中， 是多起源的，分散在变形菌门 和β两个纲的多个科中， 与非光合细菌的系统发育混杂在一起。现在认为， 与非光合细菌的系统发育混杂在一起。现在认为，光 合器官的性质对种的鉴定还是重要的， 合器官的性质对种的鉴定还是重要的，但对较高分类 阶元，如科、目等则没有太大意义。 阶元，如科、目等则没有太大意义。 《伯杰氏系统细菌学手册》 《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》 1989年，第1版 2001年，第1版 以后的国际分类学权威书籍中，光合细菌的分类采用了 完全不同的分类系统。
醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）只有红球形菌属（Rhodopila） 1个属。
• （2）
红细菌目（Rhodobacterales） 有1科 （红细菌科，Rhodobacteraceae）4属： 红细菌 属 (Rhodobacter) 、 红 海 菌 属 （Rhodothalassium）、小红卵菌属(Rhodovulum) 和最近才发现的Rhodobaca。
大学培训基地
菌种不纯 菌种鉴定不准 实验环境因子复杂，实验数据缺乏统计学分 析 应用效果评价困难
光合细菌分类鉴定研究进展
《伯杰细菌鉴定手册》 《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》 》 1923年第1版 1974年第8版 1994年第9版 都停留在对光合细菌的形态生理描述上，所有的光 合细菌都被单独放到红螺菌目1个目中
• （3） 根瘤菌目（Rhizobiales） 有3科7属。 • 慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）有红假单胞菌属 • •
（Rhodopseudomonas）、红芽生菌属（Rhodoblastus） 2个属。 生 丝 微 菌 科 （ Hyphomicrobiaceae ） 有 芽 生 绿 菌 属 (Blastochloris)、红微菌属（Rhodomicrobium）、红菌 属（Rhodobium）3个属。 红 游 动 菌 科 （ Rhodobiaceae ） 有 红 游 动 菌 属 （Rhodoplanes）和Roseospirillum 2个属。
Phaeospirillum（褐螺菌属） Roseospira (玫瑰螺菌属)
• 1999.3.中国科学院微生物研究所博士论 文：紫色非硫细菌资源分类学研究. • 2001. 第一章，光合细菌. 东秀珠、蔡妙 英主编。常见细菌鉴定手册。 • 2004.第一章，光合细菌的培养. 成永旭主 编，饵料培养学。 • 2009. 杨素萍。微生物学报。
• 2．β变形菌纲（Betaproteobacteria） • （1）伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales） 1 •
科（丛毛单胞菌科Comamonadaceae）2个属： 红 长 命 菌 属 （ Rubrivivax ） 、 红 育 菌 属 （Rhodoferax）。 （2）红环菌目（Rhodocyclales） 1科（红环菌 科Rhodocyclaceae） 红环菌属（Rhodocyclus）。
产氧光合细菌 （产氧光养细菌） 产氧光养细菌） 光合细菌
蓝细菌门
不产氧光合细菌 （不产氧光养细菌） 不产氧光养细菌） 硫细菌
绿曲挠菌门： 绿曲挠菌门：绿曲挠菌纲 绿菌门 厚壁菌门： 厚壁菌门： 螺旋杆菌科 着色杆菌科 紫色 变形菌门 外硫红螺科 紫色非硫细菌
（紫色细菌） 好氧不产氧光养细菌 紫色细菌）
宁波大学在光合细菌方面的研究
• 中国科学院微生物菌种保藏中心的绝大多数光合 细菌菌种 • 发表2个新种，有4个可能新种待发表 • 应用DGGE跟踪确定单菌落的纯培养 • 应用分子指纹技术标记重要光合细菌菌种 • 应用分子指纹技术检测养殖水体种光合细菌群落 演替 • 光合细菌菌种质量及应用效果评价体系 • 环境细菌菌种资源库 • 养殖废水和河道废水处理菌剂开发
第二届分子微生物生态研讨班
• 中国生态学会微生物生态专业委员会宁 波大学培训基地 • 第二届分子微生物生态研讨班 • 主要培训研讨内容：
原位杂交（ 原位杂交（FISH） ） 环境样品DNA提取及其杂质去除 提取及其杂质去除 环境样品 定量PCR技术及其应用 技术及其应用 定量
• α变形菌纲
• β变形菌纲（Betaproteobacteria）
伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales） 1科 红环菌目（Rhodocyclales） 1科
红环菌科Rhodocyclaceae
• (1)
α变形菌纲 3个目6个科
红螺菌目（Rhodospirillales） 该目有2科7属。
红螺菌科（Rhodospirillaceae）
红螺菌属（Rhodospirillum） 褐螺菌属(Phaeospirillum) 红螺细菌属（Rhodospira） 红弧菌属（Rhodovibrio） Rhodovibrio 玫瑰螺菌属（Roseospira） er) 红长命菌属（Rubrivivax） 芽生绿菌属 (Blastochloris) 红芽生菌属（Rhodoblastus）
• 红螺菌属 (Rhodospirillum)
深红红螺菌 (Rsp. rubrum) 度光红螺菌 （ Rsp. photometricum） 黄褐红螺菌 （ Rsp. fulvum） 莫氏红螺菌 （ Rsp. molischianum） 中盐红螺菌 (Rsp. mediosalina)
光合细菌分类、 光合细菌分类、鉴定及保存
张德民 宁波大学生命科学与生物工程学院
• 光合细菌应用中存在的问题 • 光合细菌分类学进展 • 宁波大学在光合细菌方面的研究 • 第二届分子微生物生态研讨班
• 光合细菌应用中存在的问题
• 光合细菌分类学进展 • 宁波大学在光合细菌方面的研究 • 中国生态学会微生物生态专业委员会宁波
• 所有的紫色非硫细菌分属于变形菌门的α、
β两个纲的5个目8个科中，共21个属：
• 红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）：
沼泽红假单胞菌 （Rps. palustris） 荚膜红假单胞菌 （Rps. capsulata） 球形红假单胞菌 （Rps. sphaeroides） 胶质红假单胞菌 （Rps. geletinosa） 绿色红假单胞菌 （Rps. viridis） 嗜酸红假单胞菌 （Rps. acidophila） 粪红假单胞菌 （Rps. faecalis） Rps. Rhenobacensis