酵母双杂交培养基
酵母双杂交试剂及培养基的配置
主要试剂及培养基的配置1、40％葡萄糖：121℃灭菌15min。
2、YPDA液体培养基(1L)：20g/L peptone10g/L yeast extract定容至935ml，PH调至5.8(调之前大约6.6左右)，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入50ml 40％葡萄糖及15ml Ade。
●YPDA固体培养基另加18g/L agar。
3、－Trp－Leu液体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.154g －Trp－Leu定容至95ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖。
●固体培养基另加入1.2-1.5% Agar，以下同上。
注：配缺陷型培养基时，加入缺陷型氨基酸具体的量还要参考药品商标的注明，不同厂家及批次的药品加入的量不同。
4、－Trp液体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.154g －Trp－Leu定容至93ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖及2ml 50×Leu。
5、－Trp－Leu－His固体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.062g －Trp－Leu－His1.2-1.5% Agar定容至95ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖。
6、－Trp－His固体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.062g －Trp－Leu－His1.2-1.5% Agar定容至93ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖及2ml 50×Leu。
7、鲑鱼精DNA（ssDNA）：5mg/ml8、50％PEG：需滤灭。
9、1M LiAc：10、Z buffer：16.1g/L Na2HPO4.7H2O5.50g/L NaH2PO4.H2O0.75g/L KCl0.246g/L MgSO4.7H2OPH调至7.0，灭菌室温保存。
酵母双杂技术的原理和应用
酵母双杂技术的原理和应用一、酵母双杂技术的原理酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面：1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。
通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。
2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。
同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。
3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补DNA库中的DNA发生相互作用。
然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。
二、酵母双杂技术的应用酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面：1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。
这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。
2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。
这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。
3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作用的蛋白，从而推断目标基因的功能。
这有助于揭示基因的调控机制和功能。
4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。
5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。
酵母双杂方法(改)
培养基（1）细菌培养基LB培养基（1 L）：5 g酵母提取物，10 g氯化钠，10 g胰蛋白胨，pH 7.0；SOB培养基（1 L）：5 g酵母提取物，0.5 g氯化钠，20 g胰蛋白胨，2.5 mL 1 M氯化钾，pH 7.0，高压灭菌后在每100 mL的小份中加1 mL 1 M氯化镁。
（2）酵母生长培养基100 mL YPD培养基：1 g酵母提取物，2 g胰蛋白胨，0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。
高压后加入5 mL 40%葡萄糖；100 mL YPDA培养基：基本配方同上。
高压后加入0.8 mL 100×Ade和5 mL 40%葡萄糖；100 mL SD/-Leu培养基：0.7 g无氨基酵母氮源，0.07 g四缺物, 0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖，0.2 mL 500×Trp和0.2 mL 500×His。
100 mL SD/-Trp培养基：0.7 g无氨基酵母氮源，0.07 g四缺物, 0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖，1 mL 100×Leu和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-Ade培养基：基本成分同上。
高压后加入5 mL 40%葡萄糖，1 mL 100×Leu和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-His培养基：基本成分同上。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖和1 mL 100×Leu；100 mL SD/-Trp/-Leu培养基：基本成分同上。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基：基本成分同上。
酵母双杂交试验流程
酵母双杂交试验流程4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。
需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。
4月6号星期三（1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。
需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。
4月7号星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。
下午4点开始 8号 8点结束Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。
4月8号星期五（3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。
（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。
（5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。
8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。
（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。
（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。
（8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。
（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。
（10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。
酵母表达过程中用到的培养基
酵母表达过程中用到的培养基毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD （又称YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 μg/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交实验
酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。
酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。
(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。
(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。
(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。
(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。
（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。
（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。
(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。
(10)12000rpm离心15min。
（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。
（12）取上清液并添加等量的异丙醇。
（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。
（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。
(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。
二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。
(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。
细菌双杂交实验步骤
细菌双杂交实验步骤细菌双杂交实验是一种广泛应用于分析蛋白质相互作用的实验技术。
本实验旨在通过转化酵母菌，实现在蛋白层面上对目标蛋白的功能以及相互作用关系进行研究。
实验步骤：1. 预处理酵母菌：在含有1M sorbitol的磷酸盐缓冲液中将收获的酵母菌进行洗涤，去除培养基中的残留盐分。
之后将酵母菌放置在含有1M sorbitol的缓冲液中，30℃培养至OD600约0.8。
2. 质粒构建：将目标蛋白特异性DNA序列在质粒载体pBTM116中进行克隆，经过PCR 技术检验正常与否。
对于另一种质粒载体pTRG进行同样方式克隆另一种特异性DNA序列。
3. 转化酵母菌：在含有PEG/LiAc缓冲液的条件下将构建好的pBTM116和pTRG质粒转入酵母菌。
将转染过程的混合液置于30℃下孵育并进行热冷冲击处理。
4. 筛选阳性菌落：在缓冲盐丙氨酸担载基质体系内进行SD-GAL-HIS筛选，筛选过程中需控制pBTM116和pTRG构建物的基因簇数据库，以筛去阴性菌落。
5. 二连体验证：通过筛选得到的阳性菌落进行β-加酶和α-酶的检测，检测合成报告基因GAL1-ADE2和GAL1-HIS3是否被启动表达。
判断菌落是否发生了特异性蛋白的相互作用，形成了蛋白二连体。
6. 鉴定蛋白质相互作用：对于筛选得到的阳性菌落进行回溯筛选比对，鉴定哪些实验组应该被排除或者继续保留。
鉴定相互作用的方式可以通过质谱检测，或者利用重建蛋白ELISA技术进行。
7. 数据分析：将筛选过程中所得到的阳性菌落编号，从而得出蛋白质相互作用的列表。
针对每一对蛋白质进行表达定量，进而分析蛋白连接网络，了解蛋白质间相互作用的关系。
细菌双杂交实验是一种可行的分析蛋白质相互作用的技术手段，它为分析生物分子交互作用提供了一种新的途径。
通过细菌双杂交实验，科学家们能够对目标蛋白质的功能以及相互作用关系进行深入研究，有助于我们更好的理解生命科学中蛋白质的功能及其复杂的交互关系。
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10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）溶液：
不含-His，-Leu，-Trp，-Ura等成分的10×Dropout溶液：
氨基酸10×浓度（mg/L）称重(g)（1 L）称重(g)（500 mL）L-Isoleucine 异亮氨酸300 0.3 0.15
L-Valine 缬氨酸1500 1.5 0.75
L-Arginine HCl 精氨酸200 0.2 0.1
L-Lysine HCl 赖氨酸300 0.3 0.15
L-Methionine 蛋氨酸200 0.2 0.1
L-Phenylalanine 苯丙氨酸500 0.5 0.25
L-Threonine 色氨酸2000 2.0 1.0
L-Tyrosine 酪氨酸300 0.3 0.15
加ddH2O定容后4℃保存
100×氨基酸储备液：
每100ml溶液中分别含有下列成分，配制后保存于4℃氨基酸储备液100 mL中含量
100×His L-histidine HCl monohydrade 200 mg
100×Trp L-Trytohan 200 mg
100×Leu L-eucine 1 g
100×Uracil 200 mg
100×Adenine 400 mg
SD 培养基：
Yeast Nitrogen Base
0.17 g
(without amino acid and Ammonium Sulfate)
Ammonium sulfate 0.5 g
葡萄糖 2 g
10×DO(-His –Leu –Trp –Ura)10 ml
加ddH2O定容至100ml。
如果配固体培养基加入2％的琼脂粉。
SD相应的缺失培养基：加上除了缺失的氨基酸之外的其他的氨基酸储备液，100 ml S D+1 ml 100×氨基酸储备液。
例如：SD/-Leu：SD+100×His 、100×Trp、100×Uracil、100×Adenine各1 ml。
酵母双杂交所用试剂和培养基
试验中所需试剂包括50% PEG、1 M LiAc (10×)、10×TE Buffer、YPD Plus Liquid Medium、YPDA、SD-Leu 、SD-Trp 、X-a-Gal 、Aureobasidin A（AbA）、DMSO、NaCl、DMF等，培养基类型包括YPD、YPDA、2×YPDA、SD培养基、SD相应的缺失培养基等。
具体配制如下：
10×TE(100 mL)：Tris 1.21g，EDTA Na2 0.37g，用盐酸调pH=7.5，ddH2O定容。
10×LiAc（100 mL）：LiAc·2H2O 10.20g，冰醋酸调pH 7.5，ddH2O定容。
50% PEG（100 mL）：PEG3350 50g，ddH2O定容。
1.1×TE/LiAc（10 mL）：1.1 mL 1M LiAc，1.1 mL 10×TE Buffer，8.8 mL无菌H2O。
1×PEG/ LiAc（10 mL）：8 mL 50% PEG3350，1 mL 10×TE Buffer，1 mL 1M LiAc。
10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）溶液：L-Isoleucine 300mg，L-Valine 1500mg，L-Arginine HCl 200mg，L-Lysine HCl 300mg，L-Methionine 200mg，L-Phenylalanine 500mg，L-Threonine 2000mg，L-Tyrosine 300mg，加ddH2O定容至1000 mL, 高压灭菌20 min，4℃保存。
100×氨基酸储备液（每100 mL溶液中分别含有下列成分）：100×His L-histidine HCl monohydrade 200mg，100×Trp L-Trytohan 200mg，100×Leu Leucine 1g，100×Uracil 200mg，100×Adenine 400mg。
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，琼脂粉20g (固体平板用)，加1 L dd H2O，高压灭菌20min。
YPDA：YPD+1 mL 100×Adenine（腺嘌呤）
2×YPDA：YPDA 培养基成分加倍。