蛋白的酵母双杂交操作手册大全
酵母双杂交操作手册 by shenao
酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料:PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187pGBKT7 DNA-BD Vector (bait)pGADT7 AD Vector (prey)pGBKT7-53 Control VectorpGBKT7-Lam Control VectorpGADT7-T Control VectorpCL1 Control Vector3' DNA-BD & AD Sequencing PrimersHerring testes carrier DNAYeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a-gal(Yeast Phenotypes–––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the–or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients.Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow.+His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.+LacZ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for b-galactosidase activity.+Mel1 Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for a-galactosidase activity. MiscellaneousAde2p Protein encoded by the yeast ADE2 gene.3-AT 3-amino-1,2,4-triazole; a competitive inhibitor of the His3 protein.CHX CycloheximideDropout (supplement or solution); a mixture of specific amino acids and nucleosidesDO used to supplement SD base to make SD medium; DO solutions are missing one ormore of the nutrients required by untransformed yeast to grow on SD medium.His3p Protein encoded by the yeast HIS3gene.Minimal Synthetic Dropout medium; comprised of a nitrogen base, a carbon source SD medium (glucose or galactose), and a DO supplement.YPH Yeast Protocols HandbookSD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainPJ69-4A – + – + + –––––– + + ––– PJ69-4α1SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainAH109 – + – + + –––––– + + ––– Y187Yeast selection Bacterial selection Fusion EpitopeCloning vectorspGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycinpGADT7 AD/library HA LEU2 ampicillin Control vectorspCL1 GAL4 LEU2 ampicillinpGADT7-T AD/T-antigen HA LEU2 ampicillin pGBKT7-53 DNA-BD/p53 c-Myc TRP1 kanamycin pGBKT7-Lam DNA-BD/lamin C c-Myc TRP1 kanamycin .缩写:Ade腺嘌呤(adenine) His组氨酸(histidine) Leu亮氨酸(leucine) Trp色氨酸(tryptophan)培养基成分及配制方法:YPD & SD Base from CLONTECH already contains a carbonsource(Dextrose(glucose))YPD: 20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract, 2% Dextrose(20g/L), 20 g/L Agar (for plates only) 加入上述药品，加水至1L，调节PH值到6.5。
!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是含硫酸铵的。
（买来就加进去了的）。
如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。
（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。
酵母双杂交试验流程
酵母双杂交试验流程4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。
需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。
4月6号星期三（1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。
需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。
4月7号星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。
下午4点开始 8号 8点结束Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。
4月8号星期五（3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。
（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。
（5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。
8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。
（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。
（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。
（8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。
（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。
（10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交实验
酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。
酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。
(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。
(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。
(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。
(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。
（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。
（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。
(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。
(10)12000rpm离心15min。
（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。
（12）取上清液并添加等量的异丙醇。
（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。
（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。
(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。
二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。
(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。
!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
!!酵母双杂交操作步骤（中文翻译）（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1.次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/baitplamid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ADfuionlibrary）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2.共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin(氨苄西林)？各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-hi（组氨酸）(1000ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.60g（购买来就配好的）;葡萄糖20g(即2%)2)SD/-leu/-trp/-hi(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-leu/-trp/-hiDOupplement0.62g;（购买来就配好的）葡萄糖20g.(即2%)3)SD/-leu/-trp(1000ml)（？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.64g（购买来就配好的）;葡萄糖20g(即2%)4)SD/-leu(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-leuDOupplement0.69g;（购买来就配好的）葡萄糖20g(即2%)5)SD/-trp(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.74g;（购买来就配好的）葡萄糖20g(即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是含硫酸铵的。
（买来就加进去了的）。
如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
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质粒 DNA。
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DNA 提取缓冲液
名称 缓冲液
P1 悬浮缓冲液
P2 P3 QBT
裂解缓冲液 中和缓冲液 平衡缓冲液
QC 洗涤缓冲液 QF 洗脱缓冲液
pGBKT7
Trp1
Ampr
GAL4 AD cDNA
pACT2
Leu2
pGBKT7-bait
pACT2-cDNA
AH109（Trp,Leu,His,Ade 表达缺陷株）
Bait protein
GAL4 DNA-BD
UAS
GAL4 AD cDNA:protein
Promoter
Mel/Ade/His/LacZ reporter gene
10. 以 7m1 70％乙醇洗涤沉淀 DNA，离心 12500 rpm × 10min，4℃，小心去除上清；
11. 将沉淀的质粒 DNA 溶于 5ml TE，pH8.0 缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用 2.5
倍体积无水乙醇；l/10 体积 3.0M NaAc，pH5.2，于-20℃静置过夜；
12. 离心 12500rpm × 20min，4℃,去除上清，沉淀用 70％乙醇洗涤，超净台风干；
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第二部分 实验流程液体培养基，121℃，15 lbf/ in2 灭菌 15min
A． bacto-Tryptone
10.0g
B． bacto-Yeast Extract
13. 干燥的 DNA 溶于适量体积 TE，定量，分装 100-200ug/管(用于 1 次转化反应，约
40ul)，保存于-20℃。
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pGBKT7/bait 小规模转化酵母菌 AH109
一. 试剂：
e 用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂
物 b 交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。 生 .e 3．酵mM Tris-Cl,pH8.0; 10mM EDTA; 100ug/ml RNase A
200mM NaOH; 1%SDS
3.0M KAc,pH5.5 750mM NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇; 0.15％TritonX-100 1.0M NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇 1.25M NaCl; 50mM Tris-Cl, pH8.5; 15%异丙醇
酵母质粒电转化 大肠杆菌 KC8，抽 提分离所需质粒
所得质粒与构建于 DNA-BD 载体的目的 DNA 再次共转化酵母菌 AH109
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阳 性 克 隆 在 Xα-Gal 平板上的 再次验证，质粒 纯化、测序。
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4．GAL 系统所用酵母菌株与载体 1). GAL 系统所用酵母菌株
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蛋白的酵母双杂交实介
1. 实验原理
蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用
对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和 DNA 上特异的序列
二. 实验步骤： 1. 从 YPDA 平板上挑取生长 1-3 周、直径 2-3 mm 的 AH109 单克隆，接入 1 ml YPDA
液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入 50 ml YPDA 液体培养基中，30°C 恒温，
结合而启动相应基因的转录反应。这种 DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两
个相互独立的结构域即 DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation
Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母
双杂交实验采用的系统有 LexA 系统和 Gal4 系统两种。在 LexA 系统中，DNA 结合结构域
4.
5. 用新鲜的 LB 培养液在 1.5ml 离心管中将上述甘油菌 1:106 和 1:108 稀释； .co 取稀释菌液各 10ul 加入 90ul LB 培养液在 1.5ml 离心管中振荡混匀，涂布 LB/Amp ioe 平板(φ90mm); 37℃倒置培养过夜或 30℃培养 24-36hr,计数平板上单克隆:106 稀释)或克隆数×1010(1:108 生 .e 稀释)； 易 www 按照>2-4×104cfu/平板的浓度，涂布 LB/Amp 平板(φ150mm)，共 100 块；37℃倒
注：菌株 AH109 可利用所带的 HIS3、ADE2、MEL1 三个报道基进行筛库。 菌株 Y187 可利用所带的 IacZ 报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。 菌株 CG-1945 可被用于用环己酰亚胺来分离 BD-bait 和 AD-library 质粒。
易生w物 2). GAL 系统所用各种质粒
m 蛋白基因在强启动子的作用下，处于互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯 .c 化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。
需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体—受体作
5.0g
C． NaCl
5.0g
D． 5N NaOH 调 pH →
7.0
E. ddH2O →
1000.0 ml
* LB 固体培养平板为含有 1.8％琼脂（Agar）的 LB 培养基
LB/Amp 培养基
二．实验步骤：
1. 2. 3.
二. 实验步骤： 1. 培养菌液离心 6000 rpm×10min，4℃,每 500ml 的培养物的沉淀重悬于 50ml P1 缓冲
2. 3.
4. 5. 6. 7. 8. 9.
液;
m 加入 50m1 P2 缓冲液，倒置 4-6 次混匀，室温孵育 5min; o 加入 4℃预冷的 50ml P3 缓冲液，快速倒置 4-6 次混匀，冰浴 30min (其间再倒置混 .c 匀 4-6 次); e 将上述混合液再倒置混匀，离心 12000rpm× 30min, 4℃，保留上清； io 上清再离心 12000rpm× 15min, 4℃，留上清； 物 .eb 将上清液上样于经 35m1QBT 缓冲液平衡的 QIAGEN-tip 层析柱； 生 以 100ml QC 缓冲液洗涤层析柱 2 次； 易 w 以 35m1 QF 缓冲液洗脱吸附于层析柱上的 DNA； ww 以 0.7 倍体积异丙醇沉淀 DNA，离心 12500 rpm × 30min，4℃，小心去除上清；
由一个完整的原核蛋白 LexA 构成，转录活化结构域则由一个 88 个氨基酸的酸性的大肠杆
菌多肽 B42 构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4 系统中，BD 和 AD 分别由 Gal4
蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与 768-881aa)构成与钓 w 饵 DNA 融合的重组
构建于 DNA-BD 载体的 目的 DNA 转化酵母菌
检测钓饵蛋白 自身激活能力
质粒
AH109
酵母中质粒的提 取及 PCR 酶切分 类
阳 性 克 隆 在 Xα-Gal 平板上的 初步筛选
文 库 DNA 转 化 含 有 DNA-BD 载体的酵母菌 AH109
置培养过夜；
6. 在超净台上，将所有生长菌落的平板上加适量 LB 培养液，将菌落刮下，转入 2000ml
LB/ Amp 培养液中，37℃振荡培养 2-4hr;
7. 留取适量培养菌液以 50%无菌甘油稀释至 25%终浓度，分装，保存于-70℃;
8. 其余培养菌液 8000rpm×10min, 4℃，收集细菌；用质粒 DNA 纯化试剂盒大量抽提
折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较
之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏
感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至 1mmol/L 左右的微弱作用。许多微弱或 短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合
图一：酵母双杂交系统工作原理
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2．系统特点
同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优
势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的
研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列
m （GAL UAS）结合但不能引起转录，单独的 AD 则不能与 GAL UAS 结合，只有当 BD 与 o AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与 AD 才能与 .c GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在 BD 与 AD 要导入的酵母菌 AH109 中，通过基
1. 培养基：
YPDA 液体培养基，(121°C，灭菌 15min)
A. YPD (Clontech 公司)
15.0g
B. 0.2%Adenine
4.5ml
C. ddH2O →
300.0 ml
SD/-Trp 固体培养基，(121°C，灭菌 15min) A. SD Agar Base (Clontech 公司) B. 10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) C. 20 × Leu D. ddH2O →
4.67g 10.0 ml
5.0 ml 100.0 ml 铺 5 块平板(90-100mm)