酵母双杂交技术
酵母双杂交
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酵母双杂交
酵母双杂交是一种实验技术，用于研究酵母菌的互作关系和蛋白质相互作用。
该技术基于酵母菌的能力，通过融合两个不同的酵母菌菌株，实现蛋白质的相互作用检测。
酵母双杂交的原理是利用一对可活化转录因子的融合蛋白，一个与实验蛋白A结合，另一个与实验蛋白B结合。
当A和B结合时，转录因子活化，启动报告基因的表达。
这种实验设置允许检测蛋白质A和B之间的相互作用。
通过酵母双杂交实验，可以筛查大量的蛋白质相互作用，从而揭示酵母菌细胞中复杂的信号传导网络。
这种技术被广泛应用于研究酵母菌的生物学过程、蛋白质功能以及疾病机制等方面。
它为揭示蛋白质相互作用网络提供了一种系统的方法。
1。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交技术流程
酵母双杂交技术流程
酵母双杂交技术是一种用于鉴定蛋白质相互作用的实验方法，它可以识别某个蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用关系。
以下是酵母双杂交技术的流程：
1. 构建酵母菌株：将感兴趣的两个蛋白质编码序列分别克隆至酵母表达载体中，并插入适当的启动子和终止子后，将其转化至酵母细胞中，并筛选出正确的菌株。
2. 转化酵母菌株：将构建好的酵母菌株分别转化至两个含有互补杂交部位的酵母菌株中，使其产生可杂交的菌株。
3. 筛选正面杂交菌株：通过选择菌株在适当培养基中的生长情况或染色体特征，筛选出正面杂交的菌株。
4. 验证杂交结果：通过进一步实验验证杂交结果的准确性，例如，利用质粒转染或重组DNA重组实验等方法。
5. 鉴定蛋白质相互作用：最终确定两个蛋白质之间的相互作用关系，并进一步研究其生物学意义。
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蛋白互作常用的研究方法
蛋白互作常用的研究方法
蛋白质互作常用的研究方法包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进
行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A 的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉
淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试
验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表
达及纯化。
但是也存在一定局限性。
这些方法各有优缺点，应根据研究目的和具体情况选择合适的方法。
基于转录因子结构域设计的酵母双杂交原理
基于转录因子结构域设计的酵母双杂交原理一、概述酵母双杂交技术作为一种重要的蛋白质相互作用研究方法，已经在生物科学领域得到广泛应用。
通过酵母双杂交技术，研究人员可以快速、精确地筛选出蛋白质相互作用的靶标，从而深入了解蛋白质功能以及信号转导通路等生物学过程。
而基于转录因子结构域设计的酵母双杂交原理，为该技术的发展提供了新的思路和方法。
二、酵母双杂交原理简介酵母双杂交技术是一种利用酵母细胞内蛋白质相互作用的筛选方法。
其基本原理是利用酵母细胞内的转录因子结构域将两个感兴趣蛋白质的互补结构域连接在一起，当这两种蛋白质在酵母细胞内发生相互作用时，转录因子结构域得到激活，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断两个蛋白质是否发生了相互作用。
三、转录因子结构域设计的酵母双杂交原理在设计基于转录因子结构域的酵母双杂交实验时，首先需要选择合适的转录因子结构域。
常用的转录因子结构域有Gal4、LexA等，这些结构域在酵母细胞内可以有效地激活报告基因的表达。
将两个感兴趣蛋白质的互补结构域连接到选定的转录因子结构域上，使得它们可以在酵母细胞内形成一个复合蛋白质。
当这两个蛋白质发生相互作用时，复合蛋白质激活了选择的报告基因，从而实现了蛋白质相互作用的筛选。
四、基于转录因子结构域设计的酵母双杂交技术应用基于转录因子结构域设计的酵母双杂交技术已经在许多生物学研究中得到了广泛的应用。
通过该技术，研究人员可以快速、精确地筛选出大量的蛋白质相互作用靶标，并且可以用于分析特定蛋白质在生物学过程中的相互作用网络。
该技术还可以用于筛选潜在的药物靶标、疾病相关蛋白质等。
五、总结基于转录因子结构域设计的酵母双杂交原理为蛋白质相互作用研究提供了一种新的思路和方法。
通过该原理，研究人员可以快速、准确地筛选出具有特定蛋白质相互作用的靶标，从而深入了解蛋白质功能和信号转导通路等生物学过程。
未来，随着生物学研究的不断深入，相信基于转录因子结构域设计的酵母双杂交技术一定会发挥出更大的作用，促进科学研究的进步和发展。
酵母双杂交技术
酵母双杂交常规技术一．双杂交系统原理及应用范围蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。
而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。
酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。
前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。
Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。
将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。
当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。
特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。
它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。
具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。
酵母双杂交系统步骤
酵母双杂交系统的步骤酵母双杂交法的原理：典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
酵母双杂交法的步骤：1. 阳性克隆的筛选2. 用质粒自然分选法筛除只含有AD-文库杂合子的克隆3. 酵母杂合试验确定真阳性克隆4. 阳性克隆的进一步筛选和确证5. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究6. 阳性克隆的筛选7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆9. 阳性克隆的进一步筛选和确证扩展资料：酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
2、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
3、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中，有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。
针对实际工作中的这种需要，Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。
这项技术的关键是报道基因URA3的引入。
URA3基因在这里起到了反选择的作用，它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。
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酵母双杂交系统
1．原理
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2．试验流程
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:
2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。
2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。
2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。
利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。
3．特点
优点
蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。
酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。
缺点
尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。
1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。
双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。
因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。
2、假阳性的发生较为频繁。
所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。
而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。
3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。
使用酵母双杂交技术应注意的问题
真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。
只有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备，并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。
大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别于其他实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。
特别应提出的是，一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。
另外，若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的产品不断更新换代，要认真阅读实验指导手册，以防出现失误。
4．应用
研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。
相信随着分子生物学技术的发展与推广，酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。
酵母双杂交系统操作方法
LexA酵母双杂交系统简介
一、LexA酵母双杂交系统的设计原理
报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成
1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、
p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库
2. 酵母菌株：EGY48、EGY48
（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）
3. 大肠杆菌菌株： KC8株
4. 对照质粒：
质粒用途
pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照
pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照
pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒
5. 引物：
pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
三、酵母双杂交实验的基本流程
1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。
2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。
4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-
His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
(含有Gal/Raf)
pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝阳性对照
pLexA SD/-His，-Ura 白阴性对照
PlexA-X SD/-His，-Ura 白没有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝具有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长酵母细胞毒性
4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。
能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少
4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
精心。