细胞培养工作流程样本
细胞培养基本步骤
细胞培养基本步骤细胞培养是一项重要的生物技术，涉及到多个步骤。
以下是细胞培养的基本步骤：1. 准备细胞培养环境：细胞培养需要在无菌的环境中进行，因此需要准备无菌操作台、培养箱、显微镜、细胞计数器等设备，确保培养环境符合要求。
2. 细胞复苏：从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的细胞，快速转移到37℃水浴中解冻。
然后将细胞移至培养瓶中，加入适量培养基，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布。
3. 细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，可以进行传代。
将原培养瓶中的培养基吸出，加入适量胰蛋白酶，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶与细胞接触。
等待几分钟，待细胞变圆并从瓶底脱落，将胰蛋白酶吸出。
然后加入新配置的培养基，用吸管吹打细胞团块，使其分散成单个细胞。
最后将细胞悬液移至新的培养瓶中，放在培养箱中继续培养。
4. 细胞冻存：当需要进行长期保存时，可以将细胞冻存。
将细胞从培养箱中取出，离心收集，用适量细胞冻存液重悬细胞。
然后将细胞悬液分装到冻存管中，放入-80℃冰箱或液氮中保存。
5. 细胞观察：在细胞培养过程中，需要定期观察细胞的生长情况。
通过显微镜观察细胞的形态、密度等指标，判断细胞的生长状态和是否发生异常。
如发现异常情况，应及时采取措施处理。
6. 细胞计数和活力检测：采用细胞计数器或血球计数板进行细胞计数，同时检测细胞的活力。
一般采用台盼蓝染色法或荧光染色法进行检测。
7. 细胞换液和传代：根据需要，定期更换新鲜的培养基，以保证细胞的营养需求。
同时，在传代过程中要注意细胞的消化程度和生长情况，避免过度生长或未充分消化导致细胞状态不佳。
总之，细胞培养是一项技术性很强的工作，需要严格的操作规程和细致的观察。
通过不断实践和总结经验，可以提高细胞培养的成功率和稳定性。
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程细胞培养是一种将动植物细胞在体外条件下进行繁殖和生长的技术。
它是许多生物学研究和应用领域的重要工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药物研发、生物工程等领域。
细胞培养的工作流程包括以下几个主要步骤：2.细胞株的建立：细胞株是一组具有相同遗传特性的细胞，通常可以通过原代培养、扩增和传代等方法建立。
原代细胞通常来自新鲜组织，将其接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中，细胞在适宜条件下会开始生长和分裂形成细胞株。
3.细胞培养基的选择：细胞培养基是提供细胞生长和繁殖所需的营养物和生长因子的培养介质。
根据不同细胞类型的要求，可以选择不同的培养基配方。
培养基常见的成分包括无菌水、氨基酸、糖类、脂质、无菌血清、维生素等。
4.细胞的传代：细胞在培养皿中进行繁殖和分裂，当细胞密度达到一定程度时，需要将细胞进行传代以保持细胞的健康和增殖能力。
传代的目的是将细胞分离并分散在新的培养皿中，以便细胞可以继续生长和繁殖。
5.细胞的准备和植入：根据实验设计和研究目的，将所需的细胞接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中。
细胞培养条件通常包括适宜温度（通常为37摄氏度）、无菌条件、恒定的pH值、适宜的气氛（如5%CO2），以及提供细胞所需的营养物和生长因子。
6.细胞的观察和维护：细胞在培养过程中需要定期观察其生长状态和形态特征。
可以使用显微镜对细胞进行观察和记录，以判断细胞的健康和增殖情况。
细胞的培养过程中还需要定期更换培养基，补充营养物和生长因子，以维持细胞的正常生长和繁殖。
7.细胞的实验应用：培养的细胞可以用于各种不同的实验研究和应用，包括细胞分离、细胞特征分析、药物筛选、基因表达研究等。
在实验中，细胞可能需要通过一些特殊处理，如细胞冻存、细胞分离、染色等。
细胞培养工作记录
陈涛、泌尿外科、肾脏肿瘤、男、有组织-80℃冻存记录器材：离心管架、离心管，一次性用吸量管，电动移液枪，移液枪，大枪头，酒精喷壶，75%酒精，灭菌后的剪刀、镊子，一次性用吸管，1640液，TIL培养液，培养皿，24孔培养板，冻存管2个。
流程：1.先把所有需要用到的物品耗材准备好，放置好，装枪头用大烧杯套入一层黄色塑料袋，工作人员戴好无菌手套跟口罩。
安全柜里应放好2个培养皿（打开的），里面分别放入75%酒精（润洗剪刀镊子）、1640液（润洗剪刀镊子）。
2.先剪下2块组织放入冻存管内，然后将剩余组织放入1640液中清洗，上下颠倒数次，弃去上清液，重复此操作2次。
3.将清洗后的肿瘤组织倒入一块培养皿中，用剪刀先去掉血管、血块、脂肪组织等，之后将需要的组织剪碎。
4.往24孔板中的其中6个孔每孔加1ml培养基。
并将剪碎的组织用一次性吸管吸入并均匀加入到含培养基的每个孔中，之后在培养板上写上病人姓名、性别、年龄、组织部位、处理时间等信息，并在冻存管上写上相同信息。
5.培养板放在倒置显微镜下观察，看组织块是否分布均匀，之后等待数日后进行补液换液等。
冻存管先放到-20℃冰箱中保存，处理完剩余步骤马上放-80℃冰箱中的冻存盒中保存。
6.操作完成后，处理剩余物品，操作顺序为：①先把培养板放入培养箱（培养箱内有装有灭菌水的盘子，保证生长所需湿度，37℃，5%CO2），再把冻存管放到-℃冰箱暂存。
②把培养基放到4℃冰箱中，然后把1640液也放入4℃冰箱，再拿出75%的酒精，放好，之后倒掉废液，扔掉用完的移液管、一次性吸管，并将移液枪放好。
③最后处理废弃组织，把装有酒精、1640液的培养皿合好丢进套有塑料袋的烧杯中，之后再套上一层袋子，绑好扔掉，处理完所有物品后，操作台里喷上酒精，往擦手纸上喷上酒精对工作台面进行仔细擦拭，之后，开上紫外照30min，一般情况下，如果刚好需要进行换液跟处理标本，应当先换液再处理样本。
TILs 原代培养2015.12.01 4:30 pm。
细胞培养车间工作流程
细胞培养车间工作流程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。
如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。
取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。
取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。
如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。
如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。
细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。
过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1、1工作地点检查:检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。
1、2设施检查:确认空调、传递窗工作状态完好。
1、3层流罩准备:开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1、4操作工具与试剂检查:检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液。
1、5复苏用水准备:(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备39±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36、5±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
1、6操作人员进入层流罩:穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。
1、7溶液使用前处理:辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领依据种子库管理规定进行支领,依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
细胞培养流程
细胞体外培养实验流程一、细胞复苏1.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;2.灼烧离心管管口、塞子和滴管,用滴管取5mL培养基加入离心管中;3.戴好防护用具,从液氮中取出冻存管后立即放入37℃水浴箱中,轻轻摇晃冻存管,保证细胞1min内融化;以75%酒精擦拭冻存管外部,移入无菌工作台;4.用吸细胞液的从冻存管中将细胞悬液完全吸出加入到已装有培养基的离心管中,塞子塞离心管,2000rpm,离心4min,弃上清;5.往离心管中加培养基含FBS5mL,用吸细胞悬液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,将离心管中的细胞悬液全部吸出加入到培养瓶中,培养瓶平放,轻轻晃动,使细胞均匀贴壁,标记好细胞名称、日期、培养人,放入37℃,5%的CO2恒温培养箱培养;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.离心时转速太高,离心时间过久都易对细胞造成伤害;2.滴管一定要严格分开,不能混用,防止细胞污染;3.DMSO常温下对细胞毒性较大,故冻存细胞复苏后应立即洗涤冷冻保护剂;二、细胞换液1.将培养瓶从CO2培养箱中取出,倒置显微镜下观察细胞生长状态判断生长情况,并确证未发生污染后转入无菌操作台内;2.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;3.酒精灯外焰灼烧培养瓶瓶口、瓶塞和滴管,培养瓶倾斜,吸出旧液,尽量吸净;4.吸取培养基含FBS5mL,加到培养瓶中FBS终浓度为10%;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次,再加培养基;5.将培养瓶与瓶盖过火,旋紧瓶塞后回旋半圈,平放回CO2培养箱;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.打开和盖紧培养基、培养瓶前后均需旋转灼烧瓶口和瓶盖;2.各滴管一定要严格分开,不能混用;3.将PBS注入到培养瓶中,应将液体打到没有细胞的那一面;4.培养液以没过细胞为宜;5.细胞溶液变黄或死细胞过多时换液;6.倒掉培养瓶中的培养液,瓶口应尽量远离废液缸,以免造成污染三、细胞计数和活力测定一细胞计数细胞数/mL=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数1.紫外照台30min,75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板,用干纱布或棉签再擦一遍,放好盖玻片;2.用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中吸出少许,滴加在盖玻片边缘,使悬液充满盖玻片和计数板之间,静置3min;3.观察计数：压线的记左不计右,记上不记下,成团细胞只记为1个;先用4×倍镜找出大位置,再用10×镜计数;4.计数完用75%酒精棉签擦洗盖玻片和计数板;二细胞活力测定1. 紫外照台30min,吸取细胞悬液加入试管中;2. 加入%台盼兰染液,染色2～3min;3. 吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片;4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力;死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状;注意：1.细胞计数时盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边凹槽中;2.活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用;四、细胞传代1.配完全培养基：基础培养基:FBS=1:92.取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代 ;3.紫外照台30min,75%酒精擦拭双手,将预热后的培养基、PBS、胰酶培养基等用酒精擦拭后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台;4.点燃酒精灯,将培养瓶用75%酒精擦拭后移入工作台,将瓶口和瓶盖过火灼烧;5.在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,用适量PBS清洗细胞表面,并弃去PBS;6.加入1mL %胰酶消化细胞,此时可将细胞置于37℃细胞培养箱内消化;胰酶以铺平培养瓶底部为宜;倒置显微镜下观察,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度一般2-5min;立即弃去消化液加入3mL完全培养基终止消化;注意更换吸管7.用吸细胞液的滴管轻柔吹打,保证培养瓶底的每个角落都吹打到,斜坡处不能忽略,把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入离心管中,再用滴管吹打混匀细胞悬液;8.取一滴细胞悬液进行计数,计算好细胞传代培养时稀释倍数细胞传代密度不低于5×105个/mL;9.传代：先用滴管吹打混匀细胞悬液,按一定比例稀释,标记好细胞名称,传代培养时间,培养员,细胞个数,平放入CO2培养箱继续培养;10.收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台;附：培养细胞若需给动物注射,在消化后用PBS清洗3-5次后收集细胞并计数,用PBS清洗细胞是为防止给动物注射时残留的FBS造成动物炎症;注意：1. 对于难消化的细胞在用胰酶消化前,先用1～2mL 4 ℃PBS冲洗一遍,较易消化的细胞不需要此步骤;2. 一定要防止细胞过消化因过消化,使细胞成团,不均匀,且对细胞伤害很大,影响细胞贴壁和导致生长状态差等;过消化特征：a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落,胰酶里出现很多悬浮物,为掉下来的细胞;b.培养瓶底板上本身为白茫茫细胞贴壁生长,而过消化后细胞脱壁掉下来,则可见培养瓶底板有一片片空隙;出现过消化时立即加入含FBS的培养基终止消化;3. 把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时,每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体,以防止细胞成团不均,用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害,影响在培养瓶中生长;5. 一般细胞生长铺至瓶底约80%,则可传代或用来做实验,否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化,不易用于后续实验;五、细胞冻存1.选对数增生期细胞证明无支原体污染,在冻存前1天换半量或全量培养基;与冷冻细胞应生长良好且存活率高,约为80-90%致密度;2.配制冷冻保存溶液使用前配制：另取一离心管,加入培养基、FBS10%,逐滴加入二甲基亚砜DMSO至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用; 3.依细胞传代培养的操作,收集细胞于离心管中,取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率,一般细胞冻存浓度为1-5×106个/mL;4.离心管管口和管塞过火灼烧,塞好后,2000rpm离心4min,去上清,加适量完全培养基,混匀;5.取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液DMSO最后浓度为5～10％,使细胞浓度为1～5×106cells/mL,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1～2mL/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测;严密封口后,注明细胞名称、代数、日期;6.4℃静置10min,-20℃静置30min,-80℃过夜放置,液氮槽冷冻保存;。
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细胞培养工作流程
一、Vero细胞复苏流程
1、准备
1.1工作地点检查:
检查台面、地面是否洁净, 确认无不相关物品。
1.2设施检查:
确认空调、传递窗工作状态完好。
1.3层流罩准备:
开启层流罩, 观察其运行是否正常, 用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查:
检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密, 是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物, 瓶表面是否有裂纹, 瓶塞是否松动, 溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体: MEM液、新生牛血清、 3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、 7.5%NaHCO3溶液。
1.5复苏用水准备:
( 1) 融化种子用溶液: 按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。
( 2) 百级内消毒种子用水: 1L/1支种子准备36.5±1℃含
0.1%新洁尔灭溶液。
1.6操作人员进入层流罩:
穿一层无菌连体服并戴无菌手套, 静止5分钟后方可操作。
1.7溶液使用前处理:
辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面, 旋转1周, 操作人员将翻塞翻开, 再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液
配方
辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上, 操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中, 每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧, 在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧, 充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液, 放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶( T175) 盖打开, 倾斜或直立放置酒精灯附近, 将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中( 加量: 0.3～0.4 ml/cm2) , 拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领
依据种子库管理规定进行支领, 依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
若支领数量变化培养瓶面积按比例调整, 后续操作各项用量按比例调整。
4、种子速溶
种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时, 在液氮罐颈部停留几秒, 核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。
核对无误后, 迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液( 1000ml /支种子) , 顺时针不停摇动直至融化, 将每次的速融
时间控制在1分钟内。
然后用75%的酒精消毒容器外表面, 放置在传递窗内风淋2分钟。
同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。
迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中, 百级内操作人员取出擦干。
5、移种
操作人员左手拿冻存管, 右手打开, 用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出, 缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中, 拧紧瓶盖。
6、培养
辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。
24小时内( 细胞贴壁80%) 进行换液。
7、清场
将废液倒入下水道, 废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间, 层流罩内用75%酒精消毒, 再用纯水清洁整个房间。
8、复苏后观察
第二天观察培养液颜色( PH) 是否正常, 在显微镜下观察细胞形态数量。
9、换液
换液前准备与复苏前相同。
观察培养液颜色是否正常, 有无漏
液, 看细胞是否生长良好。
用消毒剂擦拭表面后放入层流罩, 操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。
辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面, 操作人员将翻塞翻开, 再用火焰消毒瓶口及瓶塞。
操作人员右手拿住培养瓶底部, 左手拧开瓶盖, 轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。
辅助人员打开装生长液的瓶口, 并将其在火焰外焰旋转1圈后, 放置盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近, 将生长液用吸管吸取或直接倒入其中( 加量: 0.3～0.4 ml/cm2) 。
拧紧瓶口, 平放到恒温室培养。
最后按规定清场
二、细胞传代流程
1、准备
1.1工作地点检查:
检查台面、地面是否洁净, 确认无不相关物品。
1.2设施检查:
确认空调、蠕动泵工作状态完好。
1.3层流罩准备:
开启层流罩, 观察其运行是否正常, 用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查:
检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密, 是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物, 瓶表面是否有裂纹, 瓶塞是否松动, 溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
细胞传代用液体: MEM液, 新生牛血清、 3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、 7.5%NaHCO3溶液、 0.01MPBS溶液、细胞消化液( 含0.25%的胰蛋白酶溶液) 。
2、传代1操作
2.1配液
配方。