鸡胚接种
实验八 病毒鸡胚接种与细培养
兽医微生物实验教学课件
（动物医学本科专业）
动物医学系
实验八 病毒鸡胚接种与培养
目的要求：
1、了解不同日龄鸡胚接种的途径和应用。 2、掌握鸡新城疫病毒鸡胚尿囊腔接毒、收毒方法。 3、掌握鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
病毒分离培养
分离培养：动物接种——原动物/实验动物 鸡胚接种——尿囊腔、卵黄囊、尿囊膜、羊膜腔等
细胞培养——原代细胞
二倍体细胞 传代细胞
cpe观察空斑ຫໍສະໝຸດ 基因克隆/扩增组织块培养——肠管、气管环等
鸡 胚 成 纤 维 细 胞 培 养 程 序 ：
在无菌条件下采取9－10日龄鸡胚 ↓ 除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块 ↓ 用Hanks液等充分冲洗 ↓ 剪将其剪成lmm大小的碎块 ↓ 加入Hanks液或其他洗液，充分冲洗 ↓ 约4倍量的0.25％胰酶，并调整pH至7.6－7.8 ↓ 37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次 ↓ 吸弃上层胰酶溶液 ↓ 用洗液轻洗2次后 ↓ 吸管充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液 ↓ 准备细胞计数 ↓ 单层细胞培养
实验内容：
1、鸡胚的选择和接种途径：鸡胚发育正常时，可见清晰的血管和活 的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。 卵黄囊接种：6-8日龄的鸡胚； 绒毛尿囊腔接种：9-13日龄的鸡胚； 鸡胚血管注射：12-13日龄鸡胚； 羊膜腔和脑内注射：10日龄鸡胚。 2、鸡新城疫病毒接种液或接种病料的处理；照蛋、打孔；接种。接 种后的检查和收毒。 3、鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
鸡胚接种实验步骤
鸡胚接种实验步骤
鸡胚接种实验是一种常用于研究病毒感染和疫苗研发的方法。
以下是一般的鸡胚接种实验步骤：
1. 准备工作：
- 确保实验室卫生条件良好，并进行必要的消毒处理。
- 准备所需材料，包括鸡蛋（受精后的鸡蛋）、病毒样品或疫苗、适当的培养基等。
2. 取出鸡蛋：
- 使用无菌器具将鸡蛋从孵化器中取出。
- 用消毒剂擦拭鸡蛋表面，确保表面无菌。
3. 制备操作区域：
- 在实验室台面上准备一个无菌操作区域。
- 使用无菌器具将所需工具（如注射器、刀片）摆放在操作区域上。
4. 接种操作：
- 在无菌操作区域上，使用无菌器具在鸡蛋的空气室区域确定一个合适的接种点。
- 使用无菌注射器将病毒样品或疫苗注入鸡蛋内。
- 注意避免对鸡蛋内的胚胎造成机械损伤。
5. 封蛋：
- 使用无菌聚乙烯封膜或其它适当的封蛋材料将接种点封住，以防止污染和脱水。
6. 孵化：
- 将接种后的鸡蛋放回孵化器中，并根据所研究的病毒或疫苗的特性设定合适的温度和湿度。
- 根据实验需求，确定孵化时间，通常为数天至数周。
7. 结果观察：
- 在孵化结束后，取出鸡蛋，观察胚胎的发育情况。
- 根据研究的目的，可以进行进一步的分析、检测和测量。
需要注意的是，鸡胚接种实验需要在合适的实验室条件下进行，严格遵守实验室安全操作规范，并获得相关机构的许可和伦理审批。
此外，具体的实验步骤可能会因研究目的和病原体的不同而有所变化，所以在进行实验前最好参考相关的专业文献或咨询专业人士。
《鸡胚接种技术》课件
卫生管理
保持接种器具和操作区域的清 洁，防止细菌或病毒的污染。
鸡胚接种后的常见问题与处理方法
问题 鸡胚死亡 细菌感染 发育异常
处理方法
检查温度、湿度和操作技术是否合适，并调整相 应参数。
进行必要的消毒处理，更换培养基，增加卫生管 理措施。
观察并记录发育情况பைடு நூலகம்与预期结果进行对比，调 整相关因素。
总结与展望
鸡胚接种技术是一项重要的科研工具，通过研究鸡胚的发育过程，可以获得 对生命科学和医学领域的重要启示。未来，我们将继续探索和优化鸡胚接种 技术，为科学研究做出更大的贡献。
《鸡胚接种技术》PPT课件
鸡胚接种技术简介 影响鸡胚成活的因素 鸡胚接种前的准备工作 鸡胚接种过程详解 鸡胚接种后的管理要点 鸡胚接种后的常见问题与处理方法 总结与展望
鸡胚接种技术简介
鸡胚接种技术是一种重要的研究工具，用于研究鸡胚在发育过程中的变化。 研究人员可以通过接种不同物质来观察鸡胚的反应和发育情况，从而获得重 要的科学发现。
鸡胚接种前的准备工作
1 设备准备
确保接种所需的设备和材料已准备齐全，包括培养皿、接种针和培养基等。
2 培养基准备
根据实验需求制备适当的培养基，确保其成分和浓度符合实验要求。
3 消毒处理
对接种器具和操作区域进行彻底的消毒处理，以避免细菌或病毒的污染。
鸡胚接种过程详解
1
接种准备
2
将鸡胚放置在适当的接种器具中，准备
好需要使用的培养基和接种针。
3
鸡胚获取
选择具有良好质量的鸡胚，并在适当的 环境中进行保持，以避免其受到外界环 境的影响。
接种过程
使用接种针将所需物质接种到鸡胚中， 确保操作的准确性和稳定性。
病毒的鸡胚接种技术
病毒的鸡胚接种技术目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。
仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。
方法与步骤（尿囊接种为例）1．选择9～12日龄的健康鸡胚，最好是SPF鸡胚。
为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。
选好后用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。
孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。
每日最少翻蛋3次。
健康鸡胚：照蛋时可见清晰的气室、血管及鸡胚的活动。
2．病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料：加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h→高速离心，取上清液→细菌滤器滤过除菌若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。
3．照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。
4．消毒先碘酊后酒精，由内向外呈同心圆状消毒5．打孔用灭菌小锥子在在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管进行打孔，孔径以1ml注射器针头容量刺入为宜。
6．注入病毒材料用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。
7．封孔并继续孵化注射后，用熔化的石蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。
孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。
弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。
8．收毒收毒原则：（1）先冷藏再收毒。
（2）接种什么部位，收集什么部位。
（3）固液分开收集。
（4）无菌收集。
（5）冷冻保存。
收毒方法：无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，用灭菌镊子夹起并撕开或剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
实验鸡胚接种
实验鸡胚接种
xx年xx月xx日
CATALOGUE
目录
实验准备实验步骤实验数据分析实验结论实验讨论与展望
01
实验准备
1
实验人员要求
2
3
了解微生物的种类、特点、致病性及检验方法等。
具备微生物学基础知识
熟悉接种、分离、培养、鉴定等实验操作规范，并能够熟练操作。
掌握实验操作技能
遵守实验室的各项安全规章制度，注意个人防护和实验室废弃物的处理。
培养时间
根据实验需要，确定鸡胚培养的时间，以便观察和记录实验结果。
鸡胚培养
03
实验数据分析
数据记录
记录实验进行的日期。
实验日期
记录所使用鸡胚的编号，方便追踪。
鸡胚编号
记录接种的病毒或细菌剂量。
接种剂量
记录鸡胚在实验过程中表现出的症状和时间。
症状表现
数据转换
将非数值型数据进行转换，以便进行数学分析。
多样性
根据实验需求，选择不同品种、来源的鸡胚，以满足实验的多样性和代表性。
鸡胚选取
选用精细、锋利的接种针，灭菌烘干后备用。
鸡胚接种
准备接种工具
将鸡胚固定在操作台上，用接种针在鸡胚的尿囊膜上选择适宜的位置，进行无菌接种。
接种操作
接种后对鸡胚进行密封处理，以防止外界微生物的侵入。
接种后处理
培养环境
为鸡胚提供适宜的温度、湿度和气体环境，以保证鸡胚的正常发育和繁殖。
数据清洗
去除异常值、缺失值和重复数据，确保数据准确性。
数据聚合
将多个数据源的数据聚合在一起，以便更全面地评估实验结果。
数据处理
03
结论提取
基于分析和解释，提取有关实验的结论，为后续研究提供参考。
鸡胚接种技术
这些病毒被接种到尿囊腔后，可在内皮细胞中复制，
复制的病毒被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中喊 与大量的病毒。
鸡胚接种技术
——鸡胚的接种途径和方法
✪
卵黄囊接种：
这些大的病原体能在卵黄囊的内皮细胞中快速生长。
用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁殖，
鸡胚接种技术
——鸡胚的结构与生理 ✪ 鸡胚的发育过程：Day 3
鼻、腿、翅开始形成，器官出现。 尿囊开始长出，胚胎的位置与蛋的长轴垂直。 胚胎与延伸的卵黄囊血管形似蚊子。
鸡胚接种技术
——鸡胚的结构与生理 ✪ 鸡胚的发育过程：Day 4
尿囊和羊膜腔形成。 卵黄体积继续增大，卵黄囊血管包围卵黄近1/3。 胚胎与卵黄囊血管形似蜘蛛。
主要用于分离和繁殖在绒毛尿囊膜上产生斑点状和痘 可在绒毛尿囊膜上滴定这些病毒，通过产生斑和痘的 数目来计算感染性病毒颗粒的数目。 还可用于抗体滴定，因为斑和痘数目减少的程度与抗 体浓度有关。
鸡胚接种技术
——鸡胚的接种途径和方法
✪
尿囊腔接种：
应和传代培养。
用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适
✪ 卵黄囊
主要营养的存储场所，在胚胎发育早期供给鸡胚营养
✪ 卵白
在胚胎发育晚期供给鸡胚营养
鸡胚接种技术
——鸡胚的孵育和检查
✪ 受精鸡卵的选择
接种病毒的受精鸡卵应未感染已知病毒或其它微生
物，最好来自无特定病原体(Specified Pathogen
Free, SPF)鸡群。 受精卵的壳最好是白色的，利于检卵灯观察鸡胚的 发育情况。 受精卵必须新鲜，保存在5~20℃不超过10天。
鸡胚接种技术
——鸡胚的孵育和检查
鸡胚接种实验报告
鸡胚接种实验报告引言鸡胚接种实验是一种常见的生物学实验，通过将病毒或细菌接种于鸡胚中，我们可以观察到它们对胚胎发育的影响。
这种实验能够帮助我们了解病原体的传播途径、感染机制以及鸡胚对外界刺激的响应能力。
本文将就鸡胚接种实验的过程和观察结果展开论述，以期更好地了解和探索生命的奥秘。
实验材料和方法材料：新鲜鸡胚、病毒/细菌培养液方法：1. 准备培养基：将培养基配制好，并加热灭菌。
2. 取出鸡胚：在无菌条件下，取出新鲜的鸡胚，约为8-10天，保证胚胎仍处于发育阶段。
3. 接种病原体：在鸡胚卵黄囊的顶部，用无菌针缓慢注入病原体培养液。
4. 封胚：用胶带或蜡封好孔洞，保持接种处的无菌状态。
5. 孵化：将接种后的鸡胚放入孵化器中，保持适当的温度和湿度。
6. 观察：根据实验设计，每隔一段时间观察鸡胚的发育情况。
实验结果通过观察病原体接种后的鸡胚，我们可以得出一些有趣的结果。
1. 反应变化：不同病原体对鸡胚的反应变化具有差异。
一些病原体可能导致胚胎发育减缓或停滞，而另一些病原体可能导致胚胎畸形或死亡。
这些结果提供了关于病原体对于胚胎发育的影响的线索。
2. 免疫响应：鸡胚对病原体的接种可能会触发免疫响应。
我们可以观察到鸡胚的免疫系统是否能够有效地对抗病原体的入侵。
免疫细胞的增多、炎症反应的出现都可能是这一免疫响应的体现。
3. 病变形态：观察鸡胚的病变形态对于了解病原体的感染机制和病变过程非常重要。
我们可以观察到病原体在鸡胚中的定位、侵入细胞的方式以及细胞破坏的情况。
这些观察结果有助于研究病原体的致病机制，并为预防和治疗提供依据。
4. 实验变量：在鸡胚接种实验中，还可以引入一些实验变量，比如改变接种浓度、不同时间点的接种等，以观察这些变量对实验结果的影响。
通过对变量的控制和对比，可以更加准确地判断病原体对鸡胚的影响。
结论鸡胚接种实验是一种有效的方法，可以研究病原体与胚胎发育之间的关系。
通过观察鸡胚的发育情况和病变形态，我们可以了解病原体的感染机制以及胚胎对外界刺激的响应能力。
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– 实验检测法
❖血凝试验和血凝抑制试验：流感病毒的存在 ❖中和实验、IFA ❖PCR
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第五节 鸡胚接种技术的应用
病毒的培养、分离与鉴定
– 流感病毒的分离和鉴定 – 禽流感病毒的分离和鉴定
疫苗的研制
– 活疫苗和死疫苗
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二、鸡胚的孵育和检查
受精鸡卵的供给
– 没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病毒、布氏杆菌 – 培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗生素的鸡
鸡胚的孵育
– 温度为38～39 ℃ – 湿度为40％－70％ – 翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空气流通 – 通风：排出CO2和吸入O2
检卵
– 目的标记气室和胚胎位置，了解胚胎活动情况 – 血管是否明显；有无胎动；
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三、鸡胚接种途径及方法
尿囊腔接种
– 流感病毒、流行性腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒的传代 – 取9－11日龄的鸡胚 – 检卵灯下划出气室和胚胎位置 – 收集尿囊液前4 ℃冰箱过夜
羊膜腔接种
– 分离流感病毒；收集羊水和尿囊液 – 收集前4 ℃冰箱过夜，目的是冻死鸡胚，使血液凝固，避
鸡胚接种技术
前言
1911年应用鸡胚研究鸡肉瘤病毒，后可用于痘病毒、 正/副粘病毒和疱疹病毒、立克次体等
鸡胚接种技术的优点:
– 为一活的机体，有血管神经及脏器 – 可多种途径接种，病毒易繁殖，在病毒感染的膜和液体含有
大量的病毒 – 鸡胚来源充足，很少携带病毒和细菌，对多种病毒敏感，不
产生抗体
缺点：
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– 不产生特异性指征；可被食入的抗生素污染；可携带细菌 （沙门氏菌）和病毒（Rous肉瘤病毒）
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一、鸡胚的结构和生理
卵壳与壳膜：
– 卵壳位于最外层的坚硬壳层 – 壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换，因此培
养鸡胚需一定的湿度和气体
气室
– 功能主要是呼吸和调节压力
绒毛尿囊膜
免病毒凝集红细胞造成滴度的下降
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四、病毒的检测
无菌试验
– 目的:证实收集的鸡胚是否受到细菌的污染 – 方法:
❖收集鸡胚组织接种肉汤观培养 ❖37度培养36h ❖肉汤清亮则无污染,肉汤浑浊或有菌落,说明鸡胚被细菌污染
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四、病毒的检测
检测方法
– 直接观察法
❖在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹:如痘类病毒和疱疹病毒,常产生白色 或灰色痘疱,并有充血
– 壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官
羊膜
– 胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中
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尿囊腔
– 位于绒毛尿囊腔和羊膜之间 ，胚胎排泄器官 – 含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸盐 – 为减少沉淀，盐水稀释再4℃保存
卵黄囊
– 主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养
卵白
– 外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养