临床免疫学：Immunofluorescence Microscopy
免疫电镜技术(immunoelectron-microscopy-IEM)又称为免
免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。
该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。
免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。
铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。
过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。
但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。
胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。
免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
免疫学--白细胞分化抗原和黏附分子的检测
This 10-month-old patient with severe leukocyte adhesion deficiency type I ( LAD I) developed a cervical adenitis （颈淋巴结炎） caused by Klebsiella pneumoniae. Following incision and drainage, wound healing took 4 months.
可溶性黏附分子的测定方法
1、ELISA 2、RIA 3、化学发光法、时间分辨荧光
测定法等
五、 粘附分子测定的应用
1．炎症
2．肿瘤浸润和转移
3．器官移植排斥 4．自身免疫病
5．免疫缺陷病 6．肾脏疾病
7．糖尿病慢性并发症的关系
小结
• 熟悉CD分子和粘附分子检测的方法； • 了解CD分子和粘附分子检测的意义
CD (cluster differentiation)：来自不同实验室 的单克隆抗体所识别的同一种分化抗原归为 同一分化群。胞分化、成熟、活化的不同阶段表达； 不同的分化抗原可表达于同一类细胞，同一
种分化抗原可表达于不同类细胞； 可作为细胞分类、分群、分型的表面标志； 可作为鉴定细胞来源、分化阶段、活化状态
白细胞分化抗原和黏附分子的 检测
主要内容
• 白细胞分化抗原的检测 • 白细胞分化抗原检测的意义 • 粘附分子的检测 • 粘附分子检测的意义
第一节 白细胞分化抗原测定
一、 什么是白细胞分化抗原 二、 白细胞分化抗原测定 二、 白细胞分化抗原测定的应用
临床免疫学检验重点
一：名词解释1免疫学（immunology）：是研究免疫系统的结构与功能，并通过对其在免疫应答过程中所产生的免疫保护与免疫损伤机制的研究，探讨有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学科学。
2免疫球蛋白（immunoglobulin）：是B细胞经抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等液体中，约占血浆蛋白总量的20%，IgG能与相应抗原特异性结合，执行体液免疫功能。
3补体（complement）：是存在于人和脊椎动物血清与组织液中一组经活代后有酶活性的蛋白质，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故称为补体系统。
4细胞因子（cytokine）：是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的总称。
大多数细胞因子是低分子量的蛋白或糖蛋白。
5临床免疫学（clinical immunology）：是将免疫学基础理论，临床疾病与免疫学技术相结合，用于研究疾病的免疫病理机制，诊断与鉴别诊断，评价治疗效果和判断预后的多个分支学科的总称。
6亲和性（affinity）：是指抗体分子上的一个抗原结合点与一个相应抗原表位之间的结合强度，抗原抗体的亲和性取决于两者空间构型的互补的程度。
7亲和力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，亲和力与亲和性，抗体的结合价，抗原的有效抗原表位数目有关。
8免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
9半抗原（hapten）：是指仅有抗原性而无免疫原性的物质。
10免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型，简称佐剂。
11凝集反应（agglutination reaction）：是指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原的颗粒性载机与相应抗体特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
临床免疫学诊断
Rodney R. Porter Born: 8 October 1917, Newton-le-Willows, United Kingdom Died: 6 September 1985, Winchester, United Kingdom Affiliation at the time of the award: University of Oxford, Oxford, United Kingdom
César Milstein Born: 8 October 1927, Bahia Blanca, Argentina Died: 24 March 2002, Cambridge, United Kingdom Affiliation at the time of the award: MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, United Kingdom
12
Bruce A. Beutler Born: 1957, Chicago, IL, USA Affiliation at the time of the award: University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Dallas, TX, USA, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA
Jules A. Hoffmann Born: 1941, Echternach, Luxembourg
2011 Nobel Prize: "for their discoveries concerning the activation of innate immunity"
其他主治系列-临床医学检验【代码：352】-临床免疫学和免疫学检验(二)荧光免疫技术
其他主治系列-临床医学检验【代码：352】-临床免疫学和免疫学检验（二）荧光免疫技术[单选题]1.免疫荧光技术的基本原理是A.将特异性抗体标记上荧光检测抗原B.将特（江南博哥）异性抗原标记上荧光检测抗体C.将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D.将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E.以上都不对正确答案：C参考解析：免疫荧光技术中，直接法可以用于检测抗原，而间接法除了可以检测抗原外，还可以检测抗体，如抗核抗体的检测。
[单选题]2.下列描述不正确的有A.荧光免疫技术不宜作培养细胞染色B.可对标本切片中组织或细胞表面抗原进行定量和定位C.其主要步骤为标本制作、荧光抗体染色、荧光显微镜检查D.标本的制作直接影响检测结果，是成功的关键步骤E.荧光免疫技术不宜作组织细胞染色正确答案：B参考解析：B，免疫荧光技术可以定性和定位，不能定量。
[单选题]3.荧光抗体试验所没有的类型是A.直接法B.间接法C.补体结合法D.间接抑制法E.双标记法正确答案：D参考解析：免疫荧光显微技术实验的类型包括直接法、间接法、补体结合法和双标记法。
[单选题]4.能阻断红外线的透过，安装在荧光显微镜灯室聚光镜前面的是A.衍射滤板B.隔热滤板C.激光滤板D.吸收滤板E.折射滤板正确答案：B参考解析：安装在荧光显微镜灯室聚光镜前面的隔热滤板，是用来阻断红外线的。
[单选题]5.间接免疫荧光和ELISA间接法检测血清中自身抗体，正确的是A.第1抗体为羊抗人IgB.第2抗体为人IgC.第1抗体为兔抗人IgD.第1抗体为人Ig，第2抗体为羊抗人IgE.第1抗体为人Ig，第2抗体为荧光或酶标记的羊/兔抗人Ig正确答案：E参考解析：间接免疫荧光和ELISA间接法用已知抗原检测未知抗体，其第1抗体为人Ig，第2抗体为荧光或酶标记的羊/兔抗人Ig。
[单选题]6.一般用于组织切片染色的荧光抗体，其适宜的F/P值为A.1.0B.1.5C.2.0D.2.4E.3.6正确答案：B参考解析：F/P为荧光素与蛋白质的结合比率，F/P比值越大，表明抗体分子结合的荧光素越多，一般用于组织切片的荧光抗体，其F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色以F/P＝2.4为宜。
医学免疫学-副本021：免疫学检测原理
概述是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细临床免疫学检测原理一、基于抗原-抗体反应的检测方法抗原抗体结合反应的特点、影响因素、基本检测方法二、免疫细胞的测定免疫细胞的数量和功能检测三、免疫分子的检测Ig、补体、细胞因子、CD、表面受体、粘附分子、HLA型别分析四、免疫学检测技术的临床应用免疫性疾病、免疫相关分子、免疫功能检测基于抗原-抗体反应的检测方法* 应用范围：用已知抗原检测未知抗体用已知抗体检测未知抗原大分子物质药物、激素和炎性介质等各种半抗原物质一、抗原抗体反应的特点（1）高度特异性和交叉反应⏹——是血清学诊断的依据⏹抗原决定簇－超变区的结合高度特异性（2）可见性——成比例结合→决定反应结果的关键因素（3）可逆性⏹是分子间非共价键结合⏹可逆性结合一定条件下（低pH、高浓度盐、冻融等）→抗原-抗体可被解离（二）影响抗原-抗体反应的因素* 电解质中和抗原抗体复合物表面的电荷0。
85－0。
9％NaCl* 酸碱度PH6-8* 温度37℃(0-45℃)* 振荡* 抗原和抗体本身的性质1）抗体特异性、亲和力2）抗原理化性质、表位多寡和种类抗原抗体反应的基本检测方法(agglutination)凝集反应* 原理颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合→肉眼可见的凝集物* 方法直接凝集、间接凝集、间接凝集抑制试验直接凝集试验－原理：细胞(组织细胞、细菌）＋相应抗体细胞凝集一定条件下间接凝集抑制试验沉淀反应* 原理可溶性抗原与相应抗体结合→肉眼可见的凝集物* 方法单向免疫扩散，双向免疫扩散、免疫电泳沉淀反应原理扩散实验双扩实验结果分析火箭电泳对流免疫电泳补体结合试验免疫标记技术* 原理用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质→标记抗体或抗原→进行抗原-抗体反应* 优点灵敏度高、快速、可定性、定量、定位标记技术检测抗原（1）免疫荧光法(immunofluorescence，IF)* 直接荧光法。
病毒的免疫学检测
病毒的免疫学检测病毒的免疫学检测包括不同感染部位标本中特异性抗原的检测以及血清特异性抗体的检测。
一、病毒抗原的检侧 1．免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术IF技术可用于细胞培养病毒的鉴定，也适用于检测临床标本中的病毒抗原，具有迅速、特异的优点。
挺直免疫荧光技术是用荧光素挺直标志特异性抗体检测病毒抗原；间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标志二抗与特异性抗体结合，从而间接识别抗原。
近年来用法单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb)，大大提高了检测的敏捷度和精确性。
2．免疫酶法（immunoenzyme assay, IEA）其原理与应用范围同免疫荧光技术，IEA是用酶（通常是辣根或）取代荧光素标志抗体，酶催化底物形成有色产物，在一般光学显微镜下清楚可见，不需荧光显微镜，便于推广用法。
3．发射免疫测定法（radioimmunoassay, RIA)RIA分为竞争RIA和固相RIA两种办法。
竞争RIA是用同位素标志的已知抗原与标本中未标志的待检抗原竞争性结合特异性抗体的实验，将形成的复合物分别出来，用发射免疫检测仪测定其发射活性，同时与系列稀释的标准抗原测定结果举行比较，确定出待检抗原的浓度；固相RIA是用特异性抗体包被于固相载体以捕捉标本中的抗原，然后加入发射性标志的特异性抗体与抗原结合，测定其发射活性，得知抗原的量。
RIA 是最敏感的办法，其缺点在于操作烦琐、费时，且有发射污染性，不易于广泛开展。
4.酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）先将特异性抗体包被（吸附）到塑料微孔板中以捕获标本中相应抗原，然后加入酶标特异性抗体，相应抗原被夹在抗体之间，当加入酶的底物后显色，显色程度挺直反映了标本中病毒抗原的量。
因其敏感性临近RIA，又不接触发射性物质，现已被广泛应用于临床。
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Technology:
References:
• Class textbook (Human Molecular Genetics 3)
• /immunofluoresc ence-microscopy/
• National University of Singaporeu nofluor.htm
• This method is used when looking at the subcellular location of a protein of interest
Immunofluorescence Microscopy:
•See Page 162 in textbook for another diagram
Immunofluorescence Microscopy
Immunofluorescence Microscopy:
• When an antibody, or the antiimmunoglobulin antibody used to detect the antibody is labeled with a fluorescent dye
– Eg. Fluorescein emits green light – Eg. Rhodamine emits orange/red light
• By using selective filters in a fluorescence microscope only the light from the dye is detected
• Confocal fluorescent microscope: uses a computer-aided techniques to produce a extremely thin optical section of a cell or tissue
• Gives high resolution microscopy without elaborate sample preparation
The Zeiss LSM 410 confocal microscope
Technology Continued:
• Time-lapse video microscopy: sensitive digital video cameras record the movement of fluorescently labeled molecules in cell membranes and their redistribution when cells come into contact with one another
• BD Biosciences website
• Available fluorescent labels now include red, blue, cyan or yellow fluorescent proteins
Uses:
• This can be used to detect the distribution of any protein
Technique:
• Common dyes: fluorescein, rhodamine • Dyes chosen are excited by a certain light
wavelength, usually blue or green, and emit light of a different wavelength in the visible spectrum