HEK293T细胞培养ppt课件
HEK293FT细胞培养
293细胞培养293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d6a8872378563c1ec5da50e2524de518964bd36d.png)
293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
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倒 置 显 微 镜
back
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液 氮 罐
back
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293、293T细胞培养及转染一点经验
qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。
状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。
细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。
网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。
我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。
答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。
293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。
293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。
HEK-293T ACE2 细胞稳转株使用说明书
派真生物HEK-293T/ACE2 细胞稳转株使用说明书HEK-293T/ACE2 细胞稳转株HEK-293T/ACE2 细胞稳转株ACE2即血管紧张素转化酶II（Angiotensin-converting enzyme2）是一种Ⅰ型膜蛋白,其包括一个N端肽酶结构域( peptidasedomain,PD)和一个C端 Collectrin样结构域（Collectrin-ikedomain,CLD）。
ACE2的PD为冠状病毒的S蛋白提供了直接结合位点。
冠状病毒因其病毒脂质层外由棘突蛋白） spike protein,S蛋白）构成的冠状突起而得名。
冠状病毒通过S蛋白与靶细胞表面特定受体结合,然后进入细胞复制并引起宿主感染。
冠状病毒的S蛋白包含S1及S2两个亚单位,其中S1包含受体结合域（RBD）,RBD直接与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合,S2负责与宿主细胞膜融合。
当S1与宿主受体ACE2结合时,S2上的裂解位点暴露并被宿主蛋白酶切断,此过程对于病毒感染十分重要。
本细胞系是将ACE2过表达慢病毒感染293T细胞并筛选得到的稳定株。
HEK-293T/ACE2 细胞稳转株产品描述产品名称：中文名称：包装规格：特性蛋白：HEK-293T/ACE2过表达人源 ACE2 的人肾上皮细胞2管（细胞数1E+7个/管）过表达人的血管紧张素转化酶 2 蛋白（ACE2）建议第一次 1:2 传代。
2 天换液10%DMSO +90%完全培养基Puro 嘌呤抗性传代方法: 传代情况：冻存条件：备 注：检测报告：提供感染滴度数据、293T /hACE2感染图片或荧光素酶表达量结果派真生物复苏细胞：将含有2mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 5mL 培养基混合均匀。
在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，补加 4-6mL 完全培养基后吹匀。
然后将所有细胞悬液加入 10cm 皿中培养过夜，培养过夜。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
hek293t细胞基因序列
hek293t细胞基因序列摘要：1.介绍hek293t 细胞2.阐述hek293t 细胞的基因序列3.讨论hek293t 细胞基因序列的重要性正文：一、介绍hek293t 细胞hek293t 细胞是一种人类胚胎肾细胞系，它具有无限制传代的能力，并且易于培养和操作。
由于其独特的特性，hek293t 细胞被广泛应用于生物学和医学研究领域，如基因表达研究、药物筛选和病毒学研究等。
二、阐述hek293t 细胞的基因序列hek293t 细胞的基因序列是指其细胞核中所包含的基因的排列顺序。
这个基因序列决定了hek293t 细胞的生物学特性，如细胞的生长速度、细胞周期和细胞凋亡等。
目前，科学家已经对hek293t 细胞的基因序列进行了深入研究，并发现了许多与细胞生长和功能相关的关键基因。
三、讨论hek293t 细胞基因序列的重要性hek293t 细胞基因序列的重要性体现在以下几个方面：首先，了解hek293t 细胞的基因序列有助于我们深入理解细胞的生物学特性。
通过研究基因序列中的关键基因，我们可以揭示细胞生长和功能的分子机制，从而为细胞生物学研究提供理论基础。
其次，hek293t 细胞基因序列的研究可以为药物筛选提供重要线索。
通过筛选基因序列中的特定基因，我们可以找到潜在的药物靶点，从而提高药物筛选的效率和准确性。
最后，研究hek293t 细胞基因序列有助于优化细胞培养条件。
通过分析基因序列中与细胞生长和凋亡相关的基因，我们可以找到影响细胞生长的关键因素，进而调整培养条件，提高细胞培养的成功率和效率。
综上所述，hek293t 细胞基因序列对于理解细胞生物学、药物筛选和优化细胞培养条件具有重要意义。
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取50ml无菌离心管，于超净台内，加入适量DMEM培养基(含 10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度，即 制成双倍的冻存液，置室温下待用。
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HEK293细胞冻存步骤
取准备冻存的细胞，弃去培养基，以DPBS2-3ml洗细胞一次 加入0.5-1.0ml 0.05%的胰酶消化
细 胞 开 始 皱 缩 持但 细不 胞明 正显 常， 形仍 态维
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细 胞 基 本 皱 缩 胞变 吹圆 打， 可此 下时 。细
5
胞如 脱消 落化 随过 弃头 去， 的会 胰见 酶到 溶许 失液多 。流细
3
大细 不胞 再明 形致显 态密皱 ，，缩 部部变 分分小 细细， 胞胞细 皱维胞 缩持间 变正隙 圆常增
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下。 0.05%的胰酶消化液：37℃预温。 程序冻存盒（加250ml异丙醇）、二甲基亚砜(DMSO)、2ml细胞冻
存管（标记细胞名称、代数、日期）、DPBS（不含钙镁）
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HEK293细胞的冻存
冻存前的准备
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HEK293细胞冻存步骤
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细胞简介
细胞是生命活动的基本单位
1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立 了“细胞学说”的基本原则
1、细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的 2、每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的“生命” 3、新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生
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细胞培养技术平台
基因诊疗
药物筛选
细胞培养技术
蔺帅
2013年4月
.
主要内容
1
细胞简介
2
细胞培养技术平台
3 HEK293T细胞的培养具体方法与步骤
4 细胞培养的常见问题与解决方案
5
细胞间的操作注意事项
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细胞简介
细胞是生命活动的基本单位
1665年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜观察软木的 薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文Cella （小室）词.
加入0.05%（37 ℃预温 ）胰酶消化
加入12ml完全培养基（37 ℃预温 ）将细胞从细胞瓶底部冲下
1:4传代即取3ml细胞悬液加入有9ml完全培养基的新细胞瓶中
放入37℃、5%CO2继续培养
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HEK293细胞的传代
加入0.05%胰酶消化
1
2
刚 加 入 胰 酶 细 胞 还 是 致 密 单 层
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
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HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞株是转染腺病毒E1A基因的人胚肾上皮细胞，由于 容易转染且容易培养，常被用于转染试验。
HEK293T SV40大T抗原
瞬时转染 转染效率更高
HEK293 稳定转染
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HEK293T和HEK293细胞
加入新鲜培养基10-12ml吹打成细胞悬液 收集细胞悬液至50ml无菌离心管，1000rpm，5min离心.弃上清，加入适量培养基
取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，DMSO最后浓度为10%
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HEK293细胞冻存步骤
细胞浓度为1～5×106cells/ml（细胞计数），分装于已标示完全之细胞冻存管中
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HEK293细胞的传代
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HEK293细胞的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ存
随着传代的次数增加，293细胞会出现生长状态下降， 出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存， 以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
原则：慢冻
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HEK293细胞的冻存
冻存前的准备
原代培养 传代培养
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细胞的培养具体方法与步骤
原代培养
用直接从机体获得的细胞进行的培 养称为原代培养。这种培养过程主 要是采用无菌操作的方法，把组织 （或器官）从动物体内取出，经酶 消化处理，使分散成单个细胞，然 后在人工条件下培养，使其不断地 生长和繁殖。原代培养是建立各种 细胞系的第一步。
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HEK293细胞
HEK293细胞生长条件
完全培养基 10%的胎牛血清 DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺 4500mg/ml葡萄糖 ) 1%双抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin) 37℃ 5%CO2
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无菌技术
基因诊断
培养细胞 能做什么
治病机理
试管婴儿
组织工程
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细胞的培养具体方法与步骤
细胞培养细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来 自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境 中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁 殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、 病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用
将细胞冻存管放入程序冻存盒中（已加250ml异丙醇），置-80℃超低温冰箱
第二天将细胞放入液氮灌，并记录
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HEK293细胞冻存步骤
细胞冻存的注意事项
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细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到 另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消 化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
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HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
瞬时转染
在瞬时转染中重组DNA导入感染性强的细胞系已获得目的基因暂时但高 水平的表达。转染的DNA不必整合进宿主染色体，当用大量的样品需要 在短时间内分析时，尤其是在转然后的1-4天内收获细胞，所得的溶解 产物用于检测目的基因的表达，可以采用瞬时表达的方式。
稳定转染
这种细胞系中转染的目的基因整合到宿主染色体DNA中并指导适量的目 的蛋白的合成。一般来说转染细胞的效率要比瞬时转染的效率低1-2个 数量级。
制定好实验计划和操作程序（准备好实验过程中的一 切用品）
洗手和着装（75%酒精消毒）
进入超净台中的所有物品均需消毒
操作野消毒
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细胞培养耗材
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HEK293细胞的传代
待细胞的融合率达到90%时进行传代。
弃去旧细胞液
4℃遇冷的DPBS（不含Ca2+ 、Mg2+）4ml冲洗后弃液