实验食品中蜡样芽孢杆菌检验共31页文档
实验三食品中蜡样芽孢杆菌的检验
示不发酵甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从 中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计 算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所 含的蜡样芽孢杆菌数。
（2）在普通培养基上生长良好 。本菌在普通琼脂平板上，生长 的菌落呈乳白色，不透明，直径 4-6mm,边缘不整齐，表面粗糙，
呈毛玻璃状或白蜡状。
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（3）在血液琼脂平板上形成浅
灰色、不透明、似毛玻璃状的菌 落。菌落周围初呈草绿色溶血,时 间稍长即完全透明。
（4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇卵 黄多粘菌素琼脂(MYP) 上的 菌落为粉红色(表示不发酵甘露醇)
计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡样芽 孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数 ，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。
例如将0.1mL 10-4样品稀释液涂布于MYP平板上，其可疑菌落为 25个，取5个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌，则1g（mL ）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为：
酶）。阴性时应继续培养72 h再观察。
（5）溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液
一环,接种于溶菌酶肉汤中，35℃培养24h。
该菌在本培养基（含0.001％的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
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4、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌外，肠毒 素也是重要的致病因素。
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
三、微生物检验
▪ 操作步骤： 2、分离试验
取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基（MYP）上，置37℃培养12-20h，挑取可疑的 蜡状芽胞杆菌菌落接种于肉汤和营养琼脂作成纯培养，然后做证实试验。 3 证实试验 （1）镜检观察形态 （2）培养特性 （3）生化性状及分型
三、微生物检验
▪ （三）结果报告 根据证实为蜡状芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以稀释倍数，即得每 g(ml)样品中所含蜡状芽孢杆菌数。如MYP平板上的可以菌落为25个，取5个鉴定，证实为四 个，乘上稀释倍数（104），再乘上1g(ml)检样数（取的是0.1ml样)，则 N=25*4/5*104*10=2*106 报告每个g(ml)检样中含蜡状芽胞杆菌的数量（个/个g(ml))
中乳。
▪ 麦芽糖：阳性
（三）、生化反应
▪ 甘露醇：阴性
（三）、生化反应
▪ 木糖：阴性
（三）ห้องสมุดไป่ตู้生化反应
▪ 尿素酶试验：阴性
（三）、生化反应
未接种
接种
（四）、抵抗力
1、耐热； 2、对抗菌素的敏感性。
二、流行病学
（一）、细菌分布 蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已 从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种 甜点等。 在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉 和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
二、流行病学
（一）、细菌分布 以前调查各种食品514件，发现本菌：日本1641件中有193件阳性，阳性率11.8%；国内480件 中有221件阳性，阳性率46%；乳制品阳性率77%；水果、干果阳性率8.1%；肉制品阳性率26%。
蜡样芽胞杆菌检验
生化鉴定
挑取纯培养的单个菌落，进行 酪蛋白分解试验（+）、动力试验 （大多+）、V-P试验（+）、硝酸盐 还原试验（+）、糖发酵试验（+）、 溶菌酶耐性试验（+）。
根状生长试验
挑取单个可疑菌落平行划线接种于 营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h 蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征 蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛 玻璃状或融蜡状的菌落
蜡样芽胞杆菌检验 标准操作程序
国巢湖国巢
背景
革兰氏阳性芽胞杆菌 在自然界广泛存在 可引起食物中毒等食源性疾病
背景
国际上，早在1906年就有由该菌引起的病例报道，目前全世界 每年都有相当数量的病例发生
在国内，首次报告是1973年南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕 吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖 市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位
溶血试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB琼脂（胰酪胨大豆羊血琼脂） 平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。
溶血试验
蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色 毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环 苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血 现象 多数炭疽芽胞杆菌为不溶血 巨大芽胞杆菌为不溶血
使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃ ～ 50℃的培养 箱里干燥，直到平板表面的水珠消失
30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h 同一稀释度3个平板所有菌落数合计 在15CFU～150CFU典型或可疑蜡样芽 胞杆菌菌落的平板，进行计数
从典型菌落中至少挑取5个（小于5 个全选），划线接种于营养琼脂平 板， 30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h， 进行确证实验
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。
在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。
污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。
该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。
当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。
特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。
在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。
溶血。
不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。
实验安排一、稀释菌悬液的制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。
（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。
三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。
五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。
取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。
一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。
一起蜡样芽胞杆菌食物中毒调查分析
一起蜡样芽胞杆菌食物中毒调查分析2006年5月27日，苍梧县某快餐店发生一起食物中毒。
中毒患者以恶心、呕吐为主要症状。
经临床、流行病学资料调查及实验室检验，判断为一起由于食用了被蜡样芽胞杆菌污染的米饭所引起的细菌性食物中毒，现将调查分析结果报道如下。
1 流行病学调查1.1 中毒经过：2006年5月27日19时开始陆续出现病人，至5月28日0时止，共发病例22例，罹患率11.0%(22/ 200)，病人多集中在5月27日19~23时3h内发病，潜伏期最短2 h，最长6 h。
1.2 现场卫生学调查：该快餐店位于集贸市场旁边，周围环境卫生状况较差，店内基本卫生设施具备，但分餐间内未安装紫外线灯，厨师1人、服务员2人均领取健康合格证和卫生知识培训证上岗，快餐店已办理《食品卫生许可证》。
1.3 可疑食物：出现中毒的病人均于5月27日在该快餐店进晚餐，有共同的食物史。
该店晚餐共出售快餐约200份，其食谱为:鸡肉、炒肉片、炸鱼、炒猪杂、炒油菜、米饭，因此，可疑食物为该店晚餐供应的所有食物。
2 临床表现及转归大部分病人出现恶心呕吐(最多10次/h)、腹痛、腹泻(黄色水样便，最多8次/h)，个别患者头晕、头痛、发热、恶心呕吐症状尤为剧烈。
经县人民医院抗菌和对症治疗，病人病情明显好转，至28日12时大部分病人出院，无死亡病例。
3 实验室检验3.1 样品来源: 共采集样品21份。
其中，病人呕吐物2份，剩余食品6份(包括米饭1份和炒菜5份)，餐具涂抹3份(包括碗、盘)，病人肛拭子10份。
3.2 分离培养：经37 ℃24 h培养从1份剩余米饭和8份病人排泄物标本中检出形态一致的优势菌株。
普通营养琼脂平板上菌落较大，灰白色、不透明，表面似蜡状，边缘不整。
血平板上可见菌落呈浅灰色，似毛玻璃状，溶血。
在卵黄琼脂平板上菌落周围出现透明(宽4 mm左右)。
3.3 革兰染色镜检：取分离菌纯化培养后进行革兰染色镜检，镜下可见革兰阳性芽胞杆菌，菌体两端平整，芽胞不突出菌体，位于菌体中央或稍偏于一端，呈短链排列。
蜡样芽胞杆菌检测
巨大芽胞杆菌 Bacillus
megaterium + + +/-
-/+ d +/+ -
蜡样芽胞杆菌生化特征
过氧化氢酶＋；葡萄糖利用（厌氧）＋；硝酸盐还原＋；V-P试验＋； 甘露醇产酸－；酪蛋白分解＋；
6.2.1 溶血试验
• 挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB琼
脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。 • 蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白
芽胞杆菌属
• 70个种，临床上可以分离到的有一下种类：
蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群。
蜡样芽胞杆菌生物学特性
• 在营养肉汤中32℃培养3d后，芽胞形成 率在90％以上，80℃-85 ℃水浴5min10min可刺激芽胞萌发。
新国标编制说明
新国标编制说明
• 为了在食品中有效开展蜡样芽胞杆菌检测，以 保障食品安全，降低蜡样芽胞杆菌感染的风险， 防止食源性蜡样芽胞杆菌疾病的发生，我国在 1984年制定了《食品卫生微生物学检验 蜡样 芽胞杆菌检验》（GB/T 4789.14-1988）标 准，该标准的颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测， 为蜡样芽胞杆菌病的监测、预防、控制起到了 重要的作用。
• 3.检验结果与现行的其它国家的标准存在一定 差异。
提高检出率
• 蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为30～32℃。 • 经标准修订协作组验证： • 30 ℃±1 ℃ 培养48h，平均生长率93.69%。 • 30 ℃±1℃ 培养24 h，平均生长率92.28%。 • 36 ℃±1 ℃ 培养24 h。平均生长率82.32%。
蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒
• 蜡样芽胞杆菌食物中毒以夏季（6 ～ 10月） 最高。
食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验
修订原则
• （2）保持与原标准的连续性。与现有国家标 准协调统一，鉴于我国已有相关的检测方法标 准，在内容设计时多参考了目前现行的标准条 款，如样品前处理步骤与沙门菌、大肠菌群检 测方法尽量相同，在常规生化、生化分型方面 尽量沿用原标准中的方法。这样既便于试验和 操作，又节省了检测成本。
新标准与GB/T 4789.14－2003相比主要修改如下
重新修订的意义
（1）提高蜡样芽胞杆菌检出率 • 蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为30～32℃。 • 经标准修订协作组验证：蜡样芽胞杆菌在MYP培养基的 培养条件以30 ℃±1 ℃ 培养48h的生长率最高，平均生长 率达到了93.69%。其次为30 ℃±1℃ 培养24 h，平均生长 率为92.28%。生长率最低的培养条件为36 ℃±1 ℃ 培养2 4 h。平均生长率为82.32%。经统计学分析，30 ℃±1 ℃ 培养温度的生长率显著高于36 ℃±1 ℃(P﹤0.05），但在 培养温度相同的情况下，培育时间24h和48h蜡样芽胞杆菌 生长率无显著差异（P﹥0.05）。
64 45 50 64 71 50 25 52.71
74.42 112.50 74.63 91.43 120.34 54.95 73.53 82.54
（2）扩大检测范围
１. 增加食品中蜡样芽胞杆菌定性检测方法。 5家标准修订协作组，按新修订的《食品卫生微生物 学检验 蜡样芽胞杆菌检验》方法进行蜡样芽胞杆菌定 性试验结果，生肉样品的平均最低检出限为5.56 cf u/g，熟肉样品的平均最低检出限为1.94 cfu/g，米 饭样品的平均最低检出限为1.03 cfu/g，3种样品蜡 样芽胞杆菌定性试验的平均最低检出限为2.84 cfu/g
5.4 定量检测
• 5.4.1 样品的稀释 • 吸取1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品 匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操 作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每 递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
食品冷链品控专业《85. 蜡样芽胞杆菌食物中毒蜡样芽胞杆菌的测试片检测方法》
L〔g〕放入含有225mL灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内，充分振摇或置均质器中制成1:10的样品匀液。
接种：将测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置5min使培养基凝固，最后用手轻轻地压一下。
每个样品接种2片。
培养：将测试片叠在一起放回原自封袋中，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。
培养温度为36℃±1℃，培养15～24h。
结果判别：对测试片进行观察，蜡样芽胞杆菌产生典型的蓝绿色点，而大局部非目标菌如大肠杆菌、大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和阪崎肠杆菌等均被抑制。
4 附加说明
本法还可应用于从业人员体检、中毒样品和物体外表的检测，用取样棉签涂抹被测物体外表，放入装有3mL灭菌生理盐水的试管中，摇晃10s，然后取1mL接种到测试片上。
注意使用过的测试片上带有活菌，需及时按照生物平安废弃物处理原那么进行处理。
出现阳性菌落的样本，最好用其他更为可靠的方法进行验证，没有条件的话至少再取样重复检验一次。