[原创]-Western-blot转膜整个过程
Western Blot技术详细操作步骤
Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。
Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。
前处理样本并测定蛋白质浓度。
准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。
2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。
接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。
开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。
3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。
使用电转印或半干转印设备进行转移。
4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。
一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。
5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。
根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。
6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。
通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。
7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。
封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。
孵育时间需要优化。
8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。
重复步骤6的清洗方法。
9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。
等待信号产生并记录结果。
测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。
10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。
以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。
westernblot法原理
westernblot法原理
westernblot原理：蛋白质的电泳分离。
是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。
（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,g离心15min。
取上清液作为样品。
（二）电泳：制取电泳凝胶，展开sds-page。
（三）转移：（半干式转移）
1、电泳完结后将胶条割至最合适大小，用转膜缓冲液均衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和nc膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、nc膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序摆不好，滤纸、凝胶、nc膜准确对齐，每一步除去气泡，另一头g重物，将碳板上多余的液体化成。
拨打电源,恒流1ma/cm2，迁移1.5hr。
迁移完结后，断裂电源将膜抽出,生口待测膜条搞免疫系统印迹。
自己整理的western blot步骤
组织蛋白质抽提取-80℃冰冻的大鼠大脑皮质、海马组织，1mg组织加10ulRIPA，并加入蛋白酶抑制剂cocktail，加入PMSF，用电动匀浆器低速匀浆30秒，至组织完全裂解。
冰上孵育30min。
之后离心(4℃，12，000xg离心20分钟)，吸取上清，移至新的冻存管中置于-80℃冰箱保存待用。
样品变性：取预冷的25ul 5×SDS加样缓冲液加入100ul样品中，混匀，煮沸10min。
SDS-PAGE电泳（根据分子量选择不同的胶浓度）分离胶浓缩胶灌胶、上样：取一套干净的玻璃板（0.75mm），擦拭干净，按次序放置，用固定夹夹好，固定在制胶架上。
将分离胶5 ml(or 10 m1)灌入约2/3，加水或无水乙醇或异丙醇或SDS（0.1%）或正丁醇压实，待凝后（20--30min），倒出水，滤纸吸干；将配好的2ml积层胶灌入，将梳子插入，待凝后拔出梳子。
装入电泳槽内，梳子面朝里，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，内液面略高于外液面，拔出梳子，按预定顺序加样，每样品加20ul。
设预染Marker孔。
将电泳装置与电源相接，红对红，黑对黑。
凝胶上所加电压80V，当染料前沿进入分离胶后(30min)，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝刚跑出来，关闭电源。
转膜：6张滤纸l张硝酸纤维素膜把凝胶转移到一盘转移缓冲液中略为漂洗，滤纸、垫片、夹子、膜也浸入其中转膜叠放顺序：白色板-三层海绵-3层滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-3层滤纸-三层海绵-黑色板黑对黑，白对红，连接电源，0.33A（0.8～3.0mA/cm2），90min。
转膜槽放在冰中。
转膜完毕断开电源从上到下拆卸转移装置，用镊子（防手上蛋白污染膜）逐一掀去各层丽春红检测：用丽春红检测有无条带，用TBST冲洗直至红色条带消失封闭：封闭液（含10%脱脂奶粉的TBST）封闭2h，室温，一般20～24℃TBST稍微洗一下或不洗即可进行抗体孵育一抗孵育：适宜稀释倍数一抗（一般用TBST稀释，含2%的BSA（牛血清白蛋白,为终浓度））孵育置于湿盒中，4℃冰箱孵育过夜（12h以上），或室温孵育3h，均在摇床上TBST洗膜10mi n×3次二抗孵育：适当稀释倍数HRP标记的二级抗体，置于湿盒中，室温孵育2hTBST洗膜10mi n×3次抗体孵育及TBST漂洗过程都在摇床上进行。
Western blot详细操作过程
Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。
2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。
使用终浓度为1 mmol/L 。
【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。
--Western blot 详细步骤(中文版)
Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。
2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。
2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。
倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。
3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。
4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。
6.接通电源，积层胶电压为60V。
7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。
8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。
9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。
11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。
12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。
13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。
14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。
下面就跟大家讲讲接下来的步骤。
四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。
对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。
1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。
转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。
切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。
PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。
目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。
之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。
在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。
3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的WesternBlot过程步骤详解最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解最详细的W e s t e r n B l o t过程步骤详解Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
(完整版)[原创] Western blot转膜整个过程
![(完整版)[原创] Western blot转膜整个过程](https://img.taocdn.com/s3/m/10f1108a31b765ce040814d6.png)
转膜(Trarsmembran)1 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法.常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同.前者操作容易，转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少.2 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜（NC) 和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45 μm和0。
2 μm两种规格的NC膜。
大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0。
2 μm的膜了,如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素(Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
尼龙膜和NC膜的特点相似，主要用于核酸杂交。
硝酸纤维素(nitrocellulose, NC）膜:NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便.但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。
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转膜（T r a r s m e m b r a n）1转膜的定义
将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
2转移膜的选择
杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。
大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose,NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。
但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。
聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。
膜的选择主要根据：
p膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；
p不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；
p如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
几种膜的性质对比
PVDF膜NC膜尼龙膜背景低低较高
蛋白结合能力100-200μg/cm280-100μg/cm2>400ug/cm2机械强度强干的膜很脆软而结实
溶剂抗性强差差
使用前处理甲醛润湿缓冲液润湿缓冲液润湿价格高较低低
3转膜步骤（以槽式湿转为例）
1.将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。
如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
（先把PVDF膜在甲醇中浸泡约15s，小于1min，然后把膜放在1X转膜缓冲液中浸泡，然后上面铺2层滤纸浸泡）
3.装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。
切记：胶放于负极面（黑色面）。
4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治（夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面），（因为电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流350mA，1h30min）。
注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。
4转膜注意事项
1.泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min；
a.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。
b.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。
2.转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板；
3.转膜条件：0.35A/250V/1h/40min/冰浴中进行转膜（转膜过程产生大量的热，注意冷却）；
（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。
）
4.其它注意事项：
a.避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。
因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。
b.夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。
c.保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。
d.鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）。
5转膜后检测（此步可以省略）
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST（或PBST）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液或硬度墨汁染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
a.丽春红染色：蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。
b.印度墨汁染色：只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western 印迹过程。
印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。
这时，可改用其他检测方法或换用丽春红S。
注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。