western转膜
wb转膜条件公式
wb转膜条件公式【原创实用版】目录1.WB 转膜的定义和作用2.WB 转膜条件公式的构成3.如何应用 WB 转膜条件公式4.WB 转膜的常见问题和解决方法正文一、WB 转膜的定义和作用WB（Western Blot）转膜，又称为蛋白质转移，是蛋白质电泳技术中的一个重要步骤。
在 WB 实验中，将电泳分离后的蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）转移到尼龙膜（Nylon）或其他固相支持物上，以便进行进一步的检测和分析。
这一过程可以实现对蛋白质的定性和定量分析，为研究蛋白质的表达和功能提供有力依据。
二、WB 转膜条件公式的构成WB 转膜条件公式主要包括以下几个参数：1.转膜液：常用的转膜液为磷酸缓冲液（pH 7.4），能保持膜的稳定性和电荷特性。
2.转膜电压：转膜电压是驱动蛋白质从凝胶向膜转移的动力，通常选择在 50-100V 之间。
过高的电压可能导致蛋白质丢失或降解，过低的电压则可能影响转膜效率。
3.转膜时间：转膜时间取决于蛋白质的大小、电荷和转膜液的离子强度等因素。
一般来说，转膜时间越长，蛋白质转移的量越多，但也可能导致非特异性吸附增加。
通常转膜时间为 30 分钟至 2 小时不等。
4.转膜温度：转膜温度一般在 4-50 摄氏度之间选择。
温度过高可能导致蛋白质变性，影响转膜效果；温度过低则可能使转膜过程过于缓慢。
三、如何应用 WB 转膜条件公式在实际操作中，可以根据实验目的和蛋白质特性，结合转膜条件公式选择合适的转膜条件。
以下是一个简单的示例：假设我们研究的蛋白质分子量为 50kDa，带负电荷。
根据其大小和电荷特性，我们可以选择如下转膜条件：转膜液：磷酸缓冲液（pH 7.4）转膜电压：75V转膜时间：1 小时转膜温度：37 摄氏度四、WB 转膜的常见问题和解决方法在 WB 转膜过程中，可能会遇到一些问题，如蛋白质转移不充分、背景较高等。
针对这些问题，可以采取以下措施进行解决：1.提高转膜电压和时间，以增加蛋白质转移量。
Western 转膜步骤 操作方法
2
泡。 7. 将预先浸泡过的阳极侧的滤纸放置在凝胶上，确保除去进入的气泡。 8. 将预先浸泡过的转印垫放入转印模块的阴极核心。阴极核心是两块核心中较 深的一边，其电极板为暗灰色。小心取出凝胶和膜的组装体，按同样顺序放在转 印垫上，使凝胶距离阴极最近（图 2）。 9. 加入足够的预先浸泡过的转印垫，使其比阴极核心的边缘高出 0.5cm。将阳极 核心放在转印垫的上面。凝胶/膜组装体应可以稳固在转印模块的两半部分之间， 以确保所有组件完全接触。因为转印垫使用多次后会失去弹性，所以可能需要多 一块转印垫以确保转印模块的两边完全组合。当转印垫脱色并开始失去弹性时应 进行更换。 10. 将转印模块紧紧按在一起，沿滑轨放入电泳槽中。转印模块只能以一种方式 进入，所以可以在转印模块的左上角看到阳极标志。如果放置正确，转印模块右 手边倒置的黄金柱电极正好插入电泳槽右上方黄金柱电极近邻的孔中。 11. a) 对于 Xcell SureLock™:放入张力楔（tension wedge），其垂直面顶住转印模 块， 将凸柄前压，锁定电泳槽。 b) 对于 Xcell Ⅱ™ Mini-Cell：放置前楔（无螺孔），其垂直面顶住转印模块，将 后楔滑入，向后推紧。如果放置正确，后楔将不会和电泳槽上沿平齐。在后楔和 电泳槽之间会有一个狭缝。 12. 在转印模块中倒入转印缓冲液直至凝胶/膜复合层被转印缓冲液覆盖。不要将 液面至顶，这只会增加导电性和热量。 13. 通过电泳槽前端和转印模块前端的缝隙在外槽中加入 650ml 去离子水。水面 距离电泳槽上沿大概 2cm。这是用于运行过程中的散热。 14. 在上面放上盖子 15. 在电源关闭情况下，将红色和黑色导线插入电源。 16. 使用上页的条件进行转印。
wb转膜时间过长条带的变化
wb转膜时间过长条带的变化
WB（Western blotting，蛋白质印迹法）转膜时间过长可能会导
致条带出现一些变化，具体变化可能因实验条件和蛋白质的性质而异，但通常会出现以下情况：
1. 条带变弱或消失：转膜时间过长可能导致蛋白质从凝胶中迁移
到膜上的效率降低，从而使条带的强度变弱或完全消失。
2. 条带扩散：如果转膜时间过长，蛋白质可能会在膜上扩散，导
致条带变宽，清晰度降低。
3. 背景增加：转膜时间过长可能会增加非特异性结合，导致背景
噪音增加，使目标条带的识别变得困难。
为了获得最佳的结果，转膜时间通常需要根据实验条件和蛋白质
的特性进行优化。
一般来说，转膜时间应该在适当的范围内，以确保
蛋白质有效地转移到膜上，同时尽量减少条带的扩散和背景噪音。
如果你发现转膜时间过长导致条带异常，可以尝试缩短转膜时间、优化转膜缓冲液的成分、调整蛋白上样量等方法来改善结果。
同时，也要确保其他实验步骤的准确性，如凝胶电泳、抗体孵育等，以获得可靠的 Western blotting 结果。
Western快速转膜液(Powder)说明书
Western 快速转膜液(Powder)产品简介：碧云天生产的Western 快速转膜液(Powder)，即Western Rapid Transfer Buffer (Powder)，是一种粉末形态的安全无毒的用于Western 时湿法快速转膜的缓冲液。
本产品转膜快速。
使用本快速转膜液时，在400mA 恒流转膜约20-25分钟即可将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移至PVDF 膜或硝酸纤维素膜(NC 膜)等印迹膜上，并且产热少，转膜效果好。
而相同的条件下使用传统的转膜液需要转膜更长时间。
本产品安全无毒害。
本产品为预混粉末(powder)，使用前需要用水和乙醇配制，但无需调节pH 值。
本产品不含有毒有害组分，也无需使用剧毒的甲醇等试剂。
本快速转膜液的转膜效果与传统转膜液一致或略优。
本快速转膜液与传统转膜液在转膜前后的效果比较请参考图1。
图1.Western快速转膜液与传统转膜液在转膜前后的对比效果图。
上图为使用本快速转膜液的效果图，下图为使用传统转膜液的效果图，转移电极芯组件中放置两个转移三明治夹进行转膜，仅用内置冰盒进行降温。
凝胶为BeyoGel™ Plus PAGE 预制胶(Hepes, 4-20%, 15孔) (P0524)，凝胶厚度为1.5mm ；蛋白分子量标准分别为彩色预染蛋白质分子量标准(10-180kD) (P0068/P0069)和BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，上样量为6μl ；传统的转膜液为Western 转膜液(P0021A/B)；PVDF膜为PVDF 膜(进口分装, 6.6×8.5cm, 0.45μm) (FFP33)；转膜设备为MiniBlot™蛋白转膜系统(E6050)；转膜电源为BeyoPower™高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085)。
实际转膜效果会因实验条件、仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
wb转膜条件公式
wb转膜条件公式（原创实用版）目录1.WB 转膜的定义和目的2.WB 转膜的常用方法3.WB 转膜的条件公式4.WB 转膜的注意事项5.总结正文一、WB 转膜的定义和目的WB（Western Blot）转膜，又称为免疫印迹转膜，是一种将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）转移到固相支持物上的技术。
其主要目的是为了将电泳分离得到的蛋白质样品，转移到固相载体上，以便于进行后续的免疫学检测和分析。
二、WB 转膜的常用方法WB 转膜常用的方法有以下几种：1.湿式转膜：湿式转膜是最常用的 WB 转膜方法，其主要原理是利用电场和分子渗透作用，将蛋白质从凝胶中转移到固相载体上。
2.干式转膜：干式转膜则是通过暴露于干燥的气氛中，使得凝胶中的蛋白质与固相载体上的抗体结合，然后再进行洗涤和检测。
3.半干式转膜：半干式转膜则是湿式转膜和干式转膜的结合，一部分采用湿式转膜，一部分采用干式转膜。
三、WB 转膜的条件公式在进行 WB 转膜时，需要控制的条件包括：1.转膜缓冲液：转膜缓冲液的 pH 值、离子强度和蛋白酶抑制剂的浓度等，都会影响到蛋白质的转膜效果。
2.转膜时间：转膜时间过长或过短，都会影响到蛋白质的转膜效果。
3.转膜温度：转膜温度一般控制在 12-18℃，温度过高或过低都会影响到蛋白质的转膜效果。
4.固相载体：固相载体的选择和处理，也会影响到蛋白质的转膜效果。
四、WB 转膜的注意事项在进行 WB 转膜时，需要注意以下几点：1.保持实验操作的无菌性，以防止细菌污染。
2.选择合适的转膜时间和温度，避免过度转膜或转膜不足。
3.选择合适的固相载体，并正确处理和封闭。
4.使用高质量的转膜缓冲液，避免缓冲液中蛋白酶的干扰。
五、总结WB 转膜是蛋白质研究中常用的技术，其操作需要注意控制转膜缓冲液、转膜时间、转膜温度和固相载体等条件。
western 转膜及常见问题汇总
Western转膜实用技巧，赶紧Get起来Western实验中，经过SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质样品需经过“转膜”步骤，从PAGE 胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显示，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转膜要尽快进行。
转膜是对Western最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。
下面介绍一些实用技巧，赶紧Get起来吧1. 膜的选择膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因为可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白含量不确定，从而影响最终结果的可靠性。
通常小于20KDa的蛋白选择0.2um 的膜，而大于20KDa的蛋白选择0.45um的膜。
常见的膜有NC膜和PVDF膜，区别如下：2. 转膜条件不同分子量的蛋白质选择的凝胶浓度和转膜时间也是不同的，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，转膜时间较长，而低分子量蛋白用高浓度胶分离，采用较短的转3. 转膜操作注意事项（1）避免直接接触膜，全程戴手套并使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑；（2） PVDF膜具有疏水性，使用之前需用甲醇浸泡；（3）排列三明治时，尽量用干净的玻璃棒或试管赶走胶和膜之间的气泡，避免转膜不均匀；（4）确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否则会导致电流不能通过膜，从而转膜无效；（5）鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高背景，故如果选择鸡来源的抗体，最好使用**纤维素膜（NC膜）4. 转膜后丽春红染色为检测转膜是否成功，可以用丽春红进行染色，将膜放入TBST洗一次，然后置于丽春红染色工作液中，室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜，直至水变清无色，蛋白条带清晰。
Western Blot 常见问题汇总分析。
wb转膜原理
WB转膜原理一、什么是WB转膜在分子生物学研究中，Western blotting（WB）是一种常用的蛋白质检测方法。
它通过将蛋白质分离、转移到膜上并用特异性抗体进行检测，能够准确地检测目标蛋白质的存在和表达水平。
WB转膜是WB技术中的一个重要步骤，它将已经分离得到的蛋白质转移到固体支持物上，常用的支持物包括聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯二醇脲醛膜等。
WB转膜的目的是为了将蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便后续的抗体检测。
二、WB转膜的原理WB转膜的原理是利用电场作用将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
在转膜过程中，电场会使得蛋白质向阳极（阳极移动），因此要将膜放置在阳极一侧，凝胶放置在阴极一侧。
具体的WB转膜原理可以分为以下几个步骤：1. 准备工作首先，需要将蛋白质样品经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行分离，得到蛋白质的条带。
2. 选择合适的膜和缓冲液根据蛋白质的大小和特性，选择合适的膜和缓冲液。
常用的膜有聚乙烯二醇脲醛膜、聚偏氟乙烯膜等，常用的缓冲液有传输缓冲液（Tris-glycine buffer）等。
3. 建立电场将薄膜强制充湿于转印缓冲液中，然后将其与蛋白质凝胶层叠加在一起。
在薄膜上放置一个合适大小的吸水纸，再将层叠的凝胶和薄膜叠放在一个转印装置中，加上电源连接转印装置。
4. 转膜过程打开电源，通电进行转膜。
在转膜过程中，蛋白质会受到电场的作用，向阳极（薄膜）方向移动，逐渐从凝胶中转移到薄膜上。
5. 后续处理转膜完成后，将薄膜取出，可进行一些后续处理，如用Ponceau S染色检测转膜效果、去除Ponceau S染料、进行蛋白质的染色检测等。
三、注意事项和常见问题在进行WB转膜时，需要注意以下几点：1. 转膜条件的选择转膜条件包括转膜时间、电压和电流等。
不同的蛋白质样品可能需要不同的转膜条件，因此需要进行优化。
一般来说，转膜时间较长，电压较低，可以得到较好的转膜效果。
2. 防止蛋白质传输不完全蛋白质转移到薄膜上的效率可能受到多种因素的影响，如蛋白质的大小、电场的强度和转膜时间等。
western转膜条件
western转膜条件蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KDWB用膜类型、孔径：0.45 NC转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA转膜时间：60~90 minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。
蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径：0.45 PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 100 V转膜时间：60~70 min设备名字是“Bio-Rad mini”。
蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压 12 V转膜时间：30-40 min设备：“Bio-Rad mini”建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。
蛋白来源：293T细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。
转膜时间：70 min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转 Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
蛋白来源：成纤维细胞蛋白名称（可保密）：smad3蛋白分子量：54 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转 Bio-Rad蛋白来源：胰腺癌细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：16 KDa and 42 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：120 V 恒压转膜时间：90 min转膜设备：湿转 Bio-Rad蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KDWB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜0.26 A，两张膜0.3 A。
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western blot转移电泳一般操作流程
总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。
胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。
合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电转缓冲液和电转条件的选择
对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。
变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。
现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表：
槽式转印半干转印
Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米
转移参数
凝胶夹数 2 -
缓冲液要求450ml ≤200 ml
电极距离4cm 按夹层结构厚度确定
转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟
冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管-
凝胶容量
18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米-
13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列
8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个
凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列
8.6 x 6.8 厘米
通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。
所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。
电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。
而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。
需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。
经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用
丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。
具体的对于电压/电流的选择，可以参照下表。
但合适的电转条件需要根据凝胶的厚度、膜的种类、蛋白分子量、电转缓冲液选择最优化的方案。
SDS-PAGE Gels (Towbin Buffer)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽30 V/90 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 60 min
Trans-Blot半干转印系统转印槽N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min Isoelectric Focusing Gels, Native Gels, Basic Proteins, and Acid-Urea Gels (0.7% acetic acid)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽30 V/10 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 1 hr
Trans-Blot半干转印系统转印槽N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min。