组织工程支架材料在脊髓损伤修复中的应用
组织工程技术在修复骨组织中的应用
组织工程技术在修复骨组织中的应用随着人口老龄化和人们对健康生活质量的追求，骨组织修复成为医学界关注的热点之一。
骨组织缺陷的产生是多种疾病、手术、外伤等原因造成的。
传统的治疗方法包括传统的接骨术、骨移植等手术方法和一些药物手段。
然而，这些方法存在一些问题，例如手术后恢复时间长，易感染，且不能复制完整的骨组织结构。
由于这些问题，越来越多的医生和科学家把目光投向了组织工程领域。
组织工程技术是利用可生长的细胞、生物材料和生物化学因素来重建、替代人体组织和器官的一种技术，是近年来医学领域中的一项突破性技术。
在修复骨组织方面，组织工程技术可以模拟人体肌骨组织的生长过程，通过选择性的生物材料、干细胞、基质和生长因子等实现骨组织再生。
与传统手术方法不同，组织工程技术可以在保留完整骨组织结构的同时，让患者更快速地康复。
目前，组织工程技术在修复骨组织上已有很多成功应用，下面我们来详细讲解其中的一些应用。
一、三维打印技术辅助骨组织修复三维打印技术是一种立体制造技术，可以根据设计图案快速打印出所需部件。
在骨组织修复方面，三维打印技术可以根据患者的具体情况进行定制，制造出适合患者的骨修复材料，可以更精确地复制完整的骨组织结构。
同时，三维打印技术还能够制造支架和植入物，能够在手术中为患者提供更好的帮助。
三维打印技术在骨组织修复中的应用方案已经逐渐成熟，并取得了很好的效果。
通过三维打印技术制造的骨修补材料不仅能够提供高质量的复原效果，还可以减少术后恢复时间。
二、基于干细胞和生长因子的组织工程技术干细胞和生长因子是组织工程技术中的核心部分。
干细胞具有自我分化和增殖的能力，能够在合适的条件下分化为骨细胞。
而生长因子则能够促进干细胞的增殖和分化，有助于干细胞在身体中生成更多的骨细胞。
目前，通过基于干细胞和生长因子的组织工程技术替代骨组织的应用越来越多，已经成为骨组织修复的重要手段。
三、人工骨和生物可吸收材料的应用人工骨和生物可吸收材料是在修复骨组织方面广泛应用的一种材料。
胶原-壳聚糖支架对脊髓损伤后运动功能恢复作用的实验研究
D O I :10.12083/S Y S J .2020.17.016㊃论著㊀科研之窗㊃基金项目:邯郸市科学技术研究与发展计划项目(编号:16232080634)作者简介:朱旭,E m a i l :1131352580@q q .c o m ә通信作者:于国渊,E m a i l :h d z x s w e @163.c o m胶原-壳聚糖支架对脊髓损伤后运动功能恢复作用的实验研究朱㊀旭㊀于国渊ә㊀杨华堂㊀张㊀宁㊀王喜旺㊀王㊀晶㊀王如科邯郸市中心医院,河北邯郸056000ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨胶原-壳聚糖支架对脊髓损伤(s p i n a l c o r d i n j u r y,S C I )后运动功能恢复作用,为组织工程学在临床治疗脊髓损伤的应用奠定基础㊂方法㊀(1)制备胶原与壳聚糖配比为3：1的凝胶复合材料,置于真空冻干机冷冻干燥得到多孔可降解的胶原-壳聚糖支架(s c a f f o l d sS );(2)选取成年雌性S D 大鼠30只,体质量250~300g ,随机分为3组,暴露脊髓后未损伤脊髓为空白对照组(S HAM ),采用挂线法离断脊髓后未放入支架为离断损伤组(S C I )和采用挂线法离断脊髓后植入胶原-壳聚糖支架为支架组(S C I +S );(3)术后每周采用双盲法通过B a s s o -B e a t t i e -B r e s n a h a n (B B B )评分评价各组大鼠后肢运动功能的恢复;分别在术后即刻㊁术后1个月和术后2个月分别检测各组大鼠(n =5)双后肢运动电生理(m o t o r e v o k e d p o t e n t i a l s ,M E P )活动;(4)术后8周取材,石蜡切片观察H E 染色;冰冻切片观察神经丝蛋白(n e u r o f i l a m e n t ,N F )免疫荧光染色情况㊂结果㊀挂线法将缝合线穿过暴露的脊髓底部,提拉起脊髓后用手术剪刀离断,确保彻底离断脊髓组织㊂离断瞬间大鼠双下肢剧烈抽搐数次后各个关节松弛,无牵拉反射,提示造模成功㊂术后1个月和术后2个月,S C I +S 组大鼠的M E P 电生理活动㊁B B B 评分结果均明显优于S C I 组㊂H E 染色结果发现S C I +S 组损伤后形成的空洞明显少于S C I 组大鼠;N F 免疫荧光结果发现S C I +S 组相对于S C I 组更有利于脊髓损伤后的神经再生和修复㊂结论㊀孔胶原-壳聚糖支架减轻脊髓损伤后空洞的形成并促进神经纤维及轴突再生及后肢运动功能恢复,是一种具有良好应用前景的治疗脊髓损伤的支架㊂ʌ关键词ɔ㊀脊髓损伤;组织工程;胶原蛋白;壳聚糖;支架;运动功能恢复ʌ中图分类号ɔ㊀R -332㊀㊀ʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀ʌ文章编号ɔ㊀1673-5110(2020)23-2032-07S t u d y o n t h e e f f e c t o f c o l l a g e n -c h i t o s a n s c a f f o l d s o nm o t o r f u n c t i o n r e c o v e r y a f t e r s p i n a l c o r d i n j u r yZ HU X u ,Y U G u o y u a n ,Y A N G H u a t a n g ,Z HA N G N i n g ,WA N G X i w a n g ,WA N GJ i n g ,WA N GR u k e H a n d a nC e n t r a lH o s pi t a l ,H a n d a n 056000,C h i n a ʌA b s t r a c t ɔ㊀O b je c t i v e ㊀T o i n v e s t i g a t e t h e ef f e c t o f c o l l ag e n -chi t o s a n s c a f f o l do nm o t o r f u n c t i o n r e c o v e r y a f t e r s p i n a l c o r d i n -j u r y (S C I ),a n d t o l a y a f o u n d a t i o n f o r t h e c l i n i c a l a p p l i c a t i o no f t i s s u e e n g i n e e r i n g i n t h e t r e a t m e n t o f s p i n a l c o r d i n j u r y .M e t h o d s C o l l a g e n -c h i t o s a n c o m p o s i t e sw i t h t h e r a t i oo f 3:1w e r e p r e p a r e da n d f r o z e n -d r i e d i nv a c u u mf r e e z e -d r ye r t oo b t a i n p o r o u s s c af -f o l d s (S ).T h i r t y a d u l t f e m a l eS Dr a t sw e ighi n g 250-300g w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s :c o n t r o l g r o u p (S HAM ),S C I g r o u p (S C I )a n dS C I +S g r o u p w h i c hw e r eo p e r a t e du s i n g t h r e a d -d r a w i n g m e t h o da n d t h e n i m p l a n t e dc o l l a g e n -c h i t o s a ns c a f f o l d i mm e d i a t e l y a f t e r s p i n a l c o r d e x p o s u r e .B a s s o -B e a t t i e -B r e s n a h a n (B B B )s c o r ew a s u s e d t o e v a l u a t e t h e r e c o v e r y o f h i n d l i m bm o t o r f u n c t i o n i n e a c h g r o u p e v e r y w e e k a f t e r o p e r a t i o n ,a n dm o t o r e v o k e d p o t e n t i a l s (M E P )a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i mm e d i a t e l y a f t e r o p -e r a t i o n ,1m o n t ha n d2m o n t h s a f t e r o p e r a t i o no f e a c h g r o u p r e s p e c t i v e l y .A f t e r 8w e e k s ,t h e r a t sw e r e s a c r i f i c e d .T h e s p i n a l c o r d w e r eb u r i e d i n p a r a f f i n s e c t i o na n d s t a i n e dw i t h H E .T h en e u r o f i l a m e n tN F i mm u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g w a so b s e r v e db y f r o z e n s e c t i o n .R e s u l t s ㊀T h r e a d -d r a w i n g m e t h o d e n s u r e d t h a t t h e s p i n a l c o r dw a s c o m p l e t e l y d i s c o n n e c t e d a n d t h e r e l i a b i l i t y of t h em o d e l i s e n s u r e d .A t t h em o m e n t o f a m p u t a t i o n ,t h em u s c l e s o f t h e h i n d l i m b s o f r a t sw e r e f l a b b y a f t e r s e v e r e c o n v u l s i o n s ,a n d t h e r ew a s n o r e t r a c t i o n r e a c t i o n a f t e r p a i n s t i m u l a t i o n ,s ug g e s t i n g th a t t h em o d e l o f t r a n s e c t e d r a t sw a s s u c c e s s f u l .T h e r e s u l t s o fM E Pe l e c -t r o p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y a n dB B B s c o r e i nS C I +S g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y b e t t e r t h a n t h o s e i nS C I g r o u p a t 1m o n t h a n d 2m o n t h s a f t e r o p e r a t i o n .H Es t a i n i n g s h o w e d t h a t t h en u m b e r o f h o l e s i nS C I +S g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a nt h a t i nS C I g r o u p ;N F i mm u n o f l u o r e s c e n c e s h o w e d t h a t S C I +S g r o u p w a sm o r e c o n d u c i v e t on e r v e r e g e n e r a t i o na n d r e p a i r a f t e r s p i n a l c o r d i n j u r y t h a n S C I g r o u p .C o n c l u s i o n ㊀P o r o u s c o l l a g e n -c h i t o s a n s c a f f o l d c a n a l l e v i a t e t h e f o r m a t i o no f c a v i t y a f t e r s p i n a l c o r d i n j u r y ,p r o m o t e t h e ㊃2302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c .2020,V o l .23N o .23r e g e n e r a t i o no f n e r v e f i b e r s a n d a x o n s,a n d r e s t o r e t h em o t o r f u n c t i o no f h i n d l i m b s.I t i s a p r o m i s i n g s c a f f o l d f o r t h e t r e a t m e n t o f s p i n a l c o r d i n j u r y.ʌK e y w o r d sɔ㊀S p i n a l c o r d i n j u r y;T i s s u e e n g i n e e r i n g;C o l l a g e n;C h i t o s a n;S c a f f o l d s;M o t o r f u n c t i o n r e c o v e r y㊀㊀随着人类交通工具使用的不断增加,脊髓损伤(S C I)的发病率也与日俱增,S C I的高致残率给社会带来沉重的负担㊂脊髓局部不利于神经修复的主要原因是损伤后各种炎症因子的刺激,脊髓液化及空洞形成,胶质瘢痕增生及髓鞘抑制因子等共同作用导致㊂因此,S C I的治疗成为医疗界的一个巨大挑战[1-5]㊂最近研究表明,在给予足够的神经营养和适宜的生长环境下,破坏后的人类中枢神经系统可以缓慢的进行再生[6]㊂根据这项神经系统的特点,启发人们通过各种手段和方法来引导神经系统的再生,并且支持帮助神经轴突穿过损伤后的瘢痕组织,扭转抑制因子形成的微环境来治疗S C I㊂近年来,组织工程学支架的发展为脊髓的修复和再生提供了治疗思路[7-8]㊂利用组织工程仿生支架的多孔性为中枢神经纤维的攀爬提供桥梁,为轴突的延长和生长提供足够的物理和化学支撑;利用其生物相容性填补脊髓空腔;利用其低免疫原性重塑损伤后局部脊髓的微环境,减少损伤部位的胶原沉积和纤维性瘢痕形成[9-10]㊂目前该治疗方法以成为S C I研究的热点㊂另外,脊髓损伤后局部的病理生理及化学因素的改变对中枢神经的再次生长发育也起到了至关重要的作用㊂改善病理生理过程并帮助神经纤维抵抗各种炎性因子抑制是优质的支架材料必须具备的化学及生物特性[11]㊂众所周知,脊髓横断切断了大脑对脊髓的控制,导致对应的肢体运动功能和皮肤的痛温触觉及本体感觉的丧失㊂由于中枢神经系统的自我恢复能力和再生能力非常差,损伤后复杂的病理过程进一步增加了修复的难度㊂因此,S C I的致残率和致死率极高,临床治疗难度大,预后差㊂为神经的再次生长和发育提供营养支持,诱导神经纤维连接并形成完整的神经传导通路是目前探索治疗S C I的主要研究方向[12]㊂本试验通过大鼠B B B评分和电生理活动评价各组大鼠后肢运动功能的恢复㊁H E染色和N F免疫荧光染色观察支架修复脊髓损伤的效果㊂本研究运用胶原-壳聚糖支架移植到全横断脊髓损伤处,探讨这种支架对运动功能的影响,为临床治疗脊髓损伤提供依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀支架制备㊀选择新鲜牛肌腱,取剔除外膜及周围脂肪后剩余的结缔组织,用搅拌机充分研磨粉碎,在置入高速离心机离心之前先用0.05m o l/L T r i s 缓冲液浸泡10h,离心后可得到乳白色的混悬液,静置后收集沉淀㊂配置含有消化蛋白酶的醋酸溶液,持续搅拌至蛋白酶完全溶解㊂将醋酸溶液加入到收集的乳白色沉淀中,待沉淀充分溶后解取上清液㊂利用盐析法收集盐析出的沉淀物并在4ħ去离子水中充分清洗溶解,获得胶原蛋白凝胶㊂另外,将研磨后的壳聚糖粉末倒入醋酸溶液中,充分搅拌直至完全溶解,按壳聚糖ʒ胶原质量比1ʒ3的比例将溶有壳聚糖的醋酸溶液与胶原蛋白凝胶混合,充分搅拌后高速离心㊂去除上清液后在4ħ去离子水中充分清洗获得预胶化的混合材料,密封备用㊂将胶冻状的支架材料取出后置于实验型真空冷冻干燥机中24h得到固定形态的多孔隙的脊髓仿生支架㊂用1%的N a O H 溶液浸泡支架12h,反复冲洗,裁剪为3mmˑ3 mmˑ3mm的圆柱体,60C o灭菌后备用[13-14]㊂1.2㊀大鼠脊髓全横断模型的建立㊀本实验的大鼠由军事医学科学院动物饲养中心提供㊂将30只雌性S D大鼠适应性喂养1周,2d更换草料,充分喂食,术前禁食不禁水8h㊂采用腹腔注射麻醉,麻醉剂选择5%水合氯醛(7m L/k g)㊂待大鼠完全麻醉后俯卧固定㊂在背部皮毛上均匀喷洒适量酒精喷雾剂清洁背部,待毛发干燥后用电剃刀剃除背部毛发,暴露皮肤,碘伏常规消毒㊂触摸脊柱,确定T8-10棘突的位置,沿脊柱正中切开皮肤,切口约4c m,钝性分离脊柱两侧肌肉组织㊂用金属推开器推开双侧的肌肉组织,充分暴露T8-10棘突㊂止血钳提拉锥体,暴露脊柱间隙,利用咬骨钳咬开缺口并扩大,直至完全咬除对应的脊柱骨板,注意尽量沿正中方向咬除骨质暴露脊髓,避免损伤双侧静脉窦引起大出血,增加手术病死率㊂小鼠专用手术显微镜下用剪刀片沿正中划开脊髓的硬脊膜㊂将单根血管缝合线从脊髓底部穿过脊髓并提拉㊂眼科剪横断脊髓,大鼠双侧后肢抽搐数次后肌肉松弛无力,针刺无反应提示造模成功[15]㊂血凝酶减少出血,促进血液凝固,待术野完全干净后植入胶原-壳聚糖支架㊂术后大鼠分开低密度喂养,每日伤口碘伏消毒,腹腔注射青霉素预防感染,挤压膀胱辅助排尿,投放干果饼干等加强营养㊂加强手术切口护理,如出现伤口裂开及时处理,防止发生啃食现象㊂将实验动物随机分为3组,每组10只,分别为:(1)正常对照组(S H AM组);(2)单纯损伤组(S C I组);(3)胶原-壳聚㊃3302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c.2020,V o l.23N o.23糖支架组(S C I+S组)㊂1.3㊀B B B㊀运动功能评分S C I术后每周在固定时间用B B B评分量表评估各组大鼠的双后肢运动功能[16]㊂1.4㊀电生理检测㊀分别于术后即刻㊁术后1个月和术后2个月分别检测各组大鼠(n=5)双后肢运动电生理(m o t o r e v o k e d p o t e n t i a l sM E P)活动㊂5%水合氯醛(7m L/k g)腹腔注射麻醉㊂麻醉后固定在手术台㊂去除毛发并消毒后沿正中矢状切开头部皮肤及双下肢测量电极放置区域的皮肤㊂参比电极沿肌肉走行插入㊂诱发电位仪通过刺激大鼠肌肉记录运动诱发电位(M E P)的潜伏期㊁波幅及波形㊂将刺激电极置于冠状缝和矢状缝交叉处的皮质运动区,记录电极放置于胫后神经,刺激后在电位仪上记录M E P潜伏期㊁波幅及波形㊂每组5只大鼠,取平均值㊂1.5㊀H E染色㊀造模后8周,将大鼠灌流后取出脊髓组织固定在4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋切片,后做H E(h e m a t o x y l i n e o s i ns t a i n i n g)染色㊂显微镜下观察脊髓断端瘢痕形成与修复及周围组织形态学的改变㊂经过P h o t o s h o p和I P P软件分析脊髓横断处再生的组织面积,得出脊髓损伤处的损伤修复程度百分比㊂1.6㊀N F免疫荧光染色㊀造模后8周,将所有实验大鼠T7~T12脊髓行神经丝蛋白-200(N F-200)的免疫荧光染色,确定神经纤维的再生情况㊂将固定处理好的脊髓标本组织进行冰冻切片㊂含T r i t o n-X 100的P B S常温透化处理20m i n,P B S缓冲液洗3次,5m i n/次㊂5%的B S A,室温孵育20m i n㊂滴加N F一抗,4ħ过夜,P B S缓冲液洗3次,5m i n/次㊂滴加相应二抗,37ħ避光孵育50m i n,P B S缓冲液洗洗3次,5m i n/次㊂封片剂封片,在荧光显微镜下观察㊂经过P h o t o s h o p和I P P软件分析经脊髓损伤处的荧光相对密度,从而计算脊髓损伤处N F的百分比㊂1.7㊀统计学分析㊀采用S P S S21.0软件进行数据处理,计量资料采用均数ʃ标准差(xʃs)表示,组间数据比较采用t检验和双因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义㊂2㊀结果2.1㊀支架的外观㊀真空冷冻干燥机冷冻干燥后得到S支架(图1A)㊂冷冻干燥后S支架质地柔韧,尺寸与大鼠脊髓接近(图1B)㊂2.2㊀成功建立大鼠全横断损伤模型㊀图1C~F为造模的步骤㊂挂线法将缝合线穿过暴露的脊髓底部,提拉起脊髓后用手术剪刀离断,确保彻底离断脊髓组织㊂离断瞬间大鼠双下肢剧烈抽搐数次后各个关节松弛,无牵拉反射,提示造模成功㊂图1㊀A:直接冷冻干燥的胶原-壳聚糖支架;B:裁剪后的胶原-壳聚糖支架;C:暴露脊髓节段;D:挂线法;E:全横断脊髓后形成的空腔;F:植入支架F i g u r e1㊀A:D i r e c t f r e e z ed r y i n g o f c o l l a g e n-c h i t o s a ns c a f-f o l d;B:C u t i n t oc e r t a i ns h a p e;C:E x p o s u r eo fs p i n a lc o r d s e g m e n t s;D:H a n g i n g l i n e m e t h o d;E:T h ec a v i t y f o r m e d a f t e r c o m p l e t e t r a n s e c t i o no f t h e s p i n a l c o r d;F:S c a f f o l d i m-p l a n t a t i o n2.3㊀双后肢运动功能的恢复㊀术后1周,各组大鼠后肢功能无明显恢复,B B B评分组间比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂术后2周开始S C I+S组B B B 评分均明显高于S C I组,差异均有统计学意义(P< 0.05)(图2)㊂电生理是临床上被广泛认可的评价神经功能强弱的方法,根据神经传导的方向及功能分为测量运动功能的诱发电位;测量感觉功能的体感诱发电位㊂电位的潜伏期和振幅分别代表神经纤维传导的速度和兴奋性㊂该实验对脊髓损伤术后即刻㊁术后1个月和术后2个月后对各组大鼠进行电生理检测㊂从M E P 的波形图和统计图可以看出,在术后即刻S C I组和S C I+S的波形几乎检测不到(图3A~C)㊂在术后1个月和术后2个月,S C I组的潜伏期比S C I组的潜伏期明显更低(P<0.05)(图3A~B),S C I+S组的振幅比S C I组明显更高(P<0.05)(图3A和图3C)㊂㊃4302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c.2020,V o l.23N o.23图2㊀S HAM 组㊁S C I 组和S C I +S 组大鼠造模后1~8周的B B B 评分值比较F i g u r e 2㊀T h ec o m pa r i s o no ft h eB B Bs c o r e so fs h a m g r o u p ,S C I g r o u p a n d S C I +s g r o u p d u r i n g 1-8w e e k s a f -t e rm o d e l i n g㊀图3㊀造模后即刻㊁术后1个月和术后2个月电生理检测㊀A :3组M E P 波形图;B :3组M E P 潜伏期;C :3组M E P 的振幅F i g u r e 3㊀E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n i m m e d i a t e l y ,1m o n t ha n d 2m o n t h sa f t e ro pe r a t i o n .A :W a v ef o r m so f M E P i n t h r e eg r o u p s ;B :L a t e n c y o fM E P i n th r e e g r o u p s ;C :A m p li t u d e o fM E P i n t h r e e g r o u ps 2.4㊀H E 染色㊀H E 染色显示脊髓仿生支架植入体内2个月后对脊髓损伤的修复作用㊂图4展示为H E 染色㊂S C I 组H E 染色大体图,脊髓断端有明显的瘢痕增生,脊髓神经元大量死亡丢失形成空洞(图4B 和图4E )㊂S C I +S 组织结构紧凑致密,修复作用明显优于S C I 组,瘢痕和空洞较少,S C I +S 结构完整性明显优于S C I 组(图4B ㊁图4E ㊁图4C 和图4F )㊂相比单纯损伤组,植入S 支架组明显增加脊髓损伤处的损伤修复程度百分比,有显著性差异(P <0.05)(图4F )㊂图4㊀造模后2个月的3组H E 染色㊀A ㊁D :S HAM 组的H E 染色大体图;B ㊁E :S C I 组H E 染色的大体图;C ㊁F :S C I +S 组H E 染色的大体图;G :3组脊髓损伤处损伤修复程度百分比F i g u r e 4㊀H E s t a i n i n g p e r f o r m e di nt h r e e g r o u p st w o m o n t h s a f t e rm o d e l i n g .Aa n dD :H Es t a i n e df o r t h e s h a m g r o u p ;Ba n dE :H E s t a i n e d f o r t h e S C I g r o u p ;Ca n dF :H E s t a i n e d f o r t h eS C I +S g r o u p ;G :T h e p e r c e n t a g eo f r e pa i r d e g r e e o f s p i n a l c o r d i n j u r y i n t h r e e g r o u ps 2.5㊀N F 免疫荧光染色㊀图5为脊髓全横断后2个月的N F 免疫荧光染色㊂S H AM 组可见大量的具有连续性的N F 阳性纤维(红色)(图5A )㊂S C I 组未见明显具有连续性的神经纤维(图5B )㊂S C I +S 组比S C I 组可见较多具有连续性的神经纤维(图5C )㊂S C I +S 组脊髓损伤处N F 百分比明显比S C I 组的更高,差异有统计学意义(P <0.05)(图5D )㊂㊃5302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c .2020,V o l .23N o .23图5㊀造模后2个月的N F免疫荧光染色㊀A:S HAM组N F荧光;B:S C I组N F荧光;C:S C I+S组N F荧光;D:3组脊髓损伤处的N F百分比F i g u r e5㊀N F i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g2m o n t h s a f t e r m o d e l i n g.A:N F i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g o f t h e S H A M g r o u p;B:N F i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g o ft h e S C I g r o u p;C:N Fi m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g o f t h eS C I+S g r o u p;D:P e r c e n t a g e o f N F a t s p i n a l c o r d i n j u r y i n t h r e e g r o u p s3㊀讨论脊髓损伤后导致临床治疗效果不佳的主要原因是局部胶质瘢痕的形成,神经传导束的离断和大量神经细胞凋亡[17-18]㊂因此,如何克服局部瘢痕障碍同时促进神经元轴突再生㊁重建神经通路是脊髓损伤治疗的关键方面㊂组织工程的发展为脊髓治疗提供了新的治疗思路,通过合成材料的介入克服神经修复的难题,并在试验探索中取得良好的效果[19-20]㊂本实验采用真空冷冻干燥的脊髓支架治疗S C I㊂这种支架结构可以诱导断裂的神经纤维再次连接并形成完整的神经传导功能,为损伤的脊髓组织提供优良的神经生长环境[21]㊂天然材料比人工合成材料具有更多的应用优势,如良好的生物相容性㊁适宜的生物降解性㊁形态重塑性强㊁人体免疫反应低㊂因此,天然材料被广泛应用于组织工程,生物医学等领域㊂但是,天然材料最明显的缺点是力学性能差,无法为组织提供足够的力学支撑㊂天然材料中,目前人类发现的最理想的用于生物组织的天然材料便是胶原㊂已有研究证实,将胶原蛋白作为支架植入损伤的脊髓内可以延长神经细胞存活时间并促进轴突生长[22]㊂组织工程学支架是否适合作为植入物植入到生物体内,其本质是考验该种支架的理化性质,其中最重要的能够促进脊髓顺利修复的性质是适宜的吸水率㊁孔隙率和降解率[23-25]㊂同时还需要有模拟脊髓硬度和弹性的力学性能[26]㊂胶原材料的多孔性为中枢神经纤维的攀爬提供桥梁,为轴突的延长和生长提供足够的物理和化学支撑;生物相容性填补脊髓空腔;低免疫原性重塑损伤后局部脊髓的微环境,减少损伤部位的胶原沉积和纤维性瘢痕形成[27]㊂然而降解速度快㊁力学性能差导致胶原无法单独使用,因此需要结合其他材料来弥补胶原材料的缺陷[28-29]㊂壳聚糖具有良好的延展性,有利于中枢神经细胞和轴突的依附,有利于刺激神经细胞的合成分泌生长因子及营养因子等优点[30]㊂聚糖是一种长而不分支的黏多糖为主体,在糖的某些部位上共价结合若干肽链而生成的复合物㊂可在一系列细胞外酶或溶酶体中细胞内酶的催化下进行降解,是药物携带的最佳载体㊂利用壳聚糖的高力学性能弥补天然材料的缺陷,将壳聚糖与胶原蛋白交联提高胶原支架机械强度[31]㊂大鼠后肢肌肉收缩强度和运动功能的恢复是组织工程应用临床治疗S C I的最终目标㊂本实验应用多种手段检测不同时间段组织工程仿生学支架对损伤后大鼠后肢功能恢复的作用㊂活体中采用运动功能评分(B B B评分)和电生理评价双后肢感觉运动及协调功能的恢复㊂离体后主要通过脊髓H E 染色评价组织工程学支架对损伤后促进神经再次生长和发育并完成神经传导及功能恢复等方面作用;本实验不仅从大体层面证明支架对脊髓修复具有积极的作用,更进一步通过微观角度进一步证明组织工程学支架的有效性,增加了本实验的说服力㊂结果显示㊃6302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c.2020,V o l.23N o.23S C I+S组的治疗效果明显优于S C I组,表现在运动功能评分(B B B评分)和电生理评价明显优于S C I 组㊂与运动功能恢复相一致的是,从H E染色和N F 免疫荧光染色的结果可以得出,相比S C I组,支架治疗组从微观层面解释了改善了脊髓损伤后的病理过程,减轻水肿,减少瘢痕形成的原因,并证明了该支架可以明显促进神经再次生长和发育并完成神经传导,具有良好的临床应用前景㊂胶原-壳聚糖支架减轻组织空洞和胶质瘢痕的形成,促进脊髓神经纤维再生和运动功能的恢复㊂4㊀参考文献[1]㊀A L K A B I ES,B O I L E A U AJ.T h eR o l eo fT h e r a p e u t i cH y p o t h e r m i a A f t e r T r a u m a t i cS p i n a lC o r dI n j u r y--AS y s t e m a t i cR e v i e w[J].W o r l dN e u r o s u r g,2016,86:432-449.D O I:10.1016/j.w n e u.2015.09.079.[2]㊀N OMU R A H,T A T O R C H,S HO I C H E T M S,e ta l.B i o e n g i n e e r e d s t r a t e g i e s f o r s p i n a l c o r d r e p a i 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壳聚糖材料在脊髓损伤后神经再生的研究与作用★
壳聚糖材料在脊髓损伤后神经再生的研究与作用★王磊;卢明【摘要】背景：组织工程支架材料壳聚糖能复合多种种子细胞和神经因子，维持受损组织正常的解剖结构，防止胶质瘢痕挤压，对脊髓损伤后神经再生具有重要的意义。
目的：介绍壳聚糖材料在修复脊髓损伤后神经再生领域的研究现状。
方法：由第一作者检索1990至2012年 PubMed 数据库、CNKI 数据库及万方数据库有关壳聚糖材料特性、壳聚糖导管移植治疗脊髓损伤的相关文献。
结果与结论：壳聚糖具有良好的物理、化学性能，并且具有良好的生物相容性、生物降解性，免疫抗原性小和无毒性等特殊生物医学特性，与嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞及神经干细胞具有良好的亲和性。
壳聚糖材料制备的神经导管、支架能在脊髓损伤后桥接神经断端，维持神经再生的正常解剖结构，提供种子细胞及细胞因子载体，为损伤后神经再生提供良好的微环境，但目前对于壳聚糖导管的研究仍不够全面，仍有很多问题待解决。
%BACKGROUND: Nerve conduit/scaffolds of chitosan materials can be used as the carrier of seed cells and cytokines, maintaining the normal anatomic structure and preventing glial scar extrusion in the injury site. Chitosan materials have the promoting effects on neural regeneration and functional recovery. OBJECTIVE: To introduce the research status of chitosan nerve conduit/scaffolds in neural regeneration. METHODS: The first author retrieved PubMed, CNKI and Wanfang databases (1990/2012) to search the articles related to chitosan properties and chitosan nerve conduits for spinal cord injury. RESULTS AND CONCLUSION: Chitosan has excel ent physical and chemical properties, moreover, it also has special biomedical characteristics, such asgood biocompatibility and biodegradability, low immunogenicity and non-toxicity. Chitosan has a good affinity for olfactory ensheathing cells, bone marrow mesenchymal stem cells and neural stem cells. Nerveconduit/scaffolds of chitosan materials can bridge nerve stump, maintain the normal anatomic structure fol owing neural regeneration, provide seed cells and cytokine carriers, and create a healthy micro-environment for neural regeneration after spinal cord injury. Up to now, chitosan conduit research is stil not comprehensive, and there are many problems to be solved.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】6页(P525-530)【关键词】生物材料;生物材料综述;壳聚糖;脊髓损伤;种子细胞;联合移植;神经再生【作者】王磊;卢明【作者单位】湖南师范大学第二附属医院解放军第一六三医院神经外科，湖南省长沙市400003;湖南师范大学第二附属医院解放军第一六三医院神经外科，湖南省长沙市400003【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言脊髓损伤后少突胶质凋亡和轴索髓鞘脱失是造成脊髓神经功能障碍的主要原因。
组织工程在再生医学中的应用
组织工程在再生医学中的应用近年来，随着再生医学领域的快速发展，组织工程技术在临床治疗中得到了广泛的应用。
组织工程技术是将生物材料、生物因子和细胞等多种生物学组分相结合，构建三维结构体外或体内复杂组织和器官的一种技术，可以帮助人体再生缺损组织，提高治疗效果和生命质量。
本文将从组织工程技术的原理、应用及前景三个方面来阐述其在再生医学中的应用。
一、组织工程技术的原理组织工程技术是一种多学科融合的交叉学科，包含生物学、材料科学、化学、物理学等众多学科。
其核心原理在于构建三维复杂的组织和器官，实现细胞定向增殖、成形和空间排列，在生物材料、生物因子和细胞的相互作用下，形成生物功能结构体。
组织工程技术计划利用生物材料、细胞和生物因子之间的交互，构建三维复杂的结构体，以代替人体缺损组织，进而实现细胞定向增殖、成形和空间排列。
组织工程技术所构建的生物功能结构体可以用于再生医学，治疗许多常见的疾病，如糖尿病、心脏病、肝脏病等。
二、组织工程技术在再生医学中的应用1. 组织工程技术在骨折治疗中的应用传统骨折治疗方法主要是手术或身体治疗。
然而，这些过程都非常痛苦，而且需要长时间的康复期。
组织工程技术通过修复或再生骨组织，可以缩短康复时间并提高治疗效果。
组织工程技术可获得包括生物陶瓷，骨细胞生长因子等需要再生骨组织的组分，用于建立人工骨骼或帮助器官创新，从而实现手术的最终复原。
2. 组织工程技术在心血管领域中的应用心脏病是全球面临的重要公共卫生问题之一。
组织工程技术可以帮助心功能不全患者重新生长心肌组织，提高心脏的收缩力和柔韧性，促进静脉设备的再生，为心脏再生和治疗创造有利条件。
在心电生理诊断和治疗中，组织工程技术可以用于开发可移植心脏。
3. 组织工程技术在神经科学中的应用组织工程技术也可以用于改善神经受损的情况，如脊髓损伤和多发性硬化。
组织工程技术可以重新建立神经结构，促进神经细胞和胶质细胞的再生和增殖，并增强神经组织与外部环境之间的联系，生成更好的神经元-神经细胞中间键合区和分离，同时也促进活动后的康复治疗。
组织工程技术在人体组织修复中的应用研究
组织工程技术在人体组织修复中的应用研究第一章组织工程技术概述组织工程技术是一种综合技术，它结合生物学、医学、材料科学等多个学科，旨在重建或替代人体受损组织，修复人体缺陷和损伤。
作为现代医学领域中新兴的技术，组织工程技术在医学科学、机械工程学、材料科学等多个领域都有广泛的应用。
针对不同的组织损伤，在组织工程技术中应用的方法和技术也不同。
第二章组织工程技术在骨组织修复中的应用组织工程技术在骨组织修复中是最早被应用的。
传统的骨组织修复方法主要是通过移植其他部位的骨头、骨髓等物质，缺点是引起供体部位的损伤，并且难以达到理想的效果。
组织工程技术在骨组织修复中可以通过三个步骤实现：选择适当的种子细胞、植入支架材料并培养生长，最后植入到患者体内。
组织工程技术可以通过3D打印技术、纳米技术等手段构建与人体骨骼组织相似的支架材料，提高修复效果。
第三章组织工程技术在软组织修复中的应用组织工程技术在软组织修复中也有广泛的应用。
软组织包括肌肉、腱、韧带、纤维组织等，组织损伤的修复难度更大。
传统的方法主要是依靠体内新陈代谢以及药物治疗等方法实现。
组织工程技术可以通过原代细胞或成人干细胞等修复分离培育，最终形成符合生理需求的正常软组织。
第四章组织工程技术在心血管组织修复中的应用心血管组织的损伤修复一直是难点，在临床的治疗中短缺有效方法。
组织工程技术在心血管组织修复中也有广泛的应用。
通过在细胞培养中获得自体细胞，如骨髓细胞，再细胞种植到聚乳酸等支架材料上，最终植入患者体内，可以有效修复心血管组织的损伤。
第五章组织工程技术未来的应用前景随着组织工程技术不断的发展，其未来的应用前景也越来越广泛。
在医疗方面，组织工程技术可以在肝、肾等器官的修复中发挥作用。
除此之外，在军事、飞航领域也有广泛的应用前景，例如在航天员的健康管理和康复方面，或者是在保证军事人员在受伤时能够通过紧急处理缓解伤害。
结论组织工程技术在人体组织修复中的应用研究为医学界展示了一种新的手段，并且得到了广泛的认可和应用。
组织工程技术在医学领域的应用
组织工程技术在医学领域的应用现代医学界面临着许多疾病的挑战，其中不少疾病涉及到人体组织结构的损伤和缺失，这些缺失如果不能及时治疗，将会对病人的健康和生活带来极大的影响。
然而，随着医学技术的不断发展，组织工程技术出现，为医生和患者提供了一种全新的治疗方法。
组织工程技术是指通过使用人工材料和生物材料再造、修复或替换组织和器官的生长和功能。
该技术采用生物材料、细胞和生物相容材料，利用多学科交叉学科的知识，利用分子生物学、材料科学、支撑医学、电子工程等技术手段进行研究和开发，以实现人工器官、人工材料和人工组织的生长和生化机能的功能。
组织工程技术的应用组织工程技术可以应用于多种临床领域，例如：1. 整容修复：组织工程技术可以重新生成创伤的皮肤和角膜，以及用来重建口腔的软组织。
2. 骨科：组织工程技术可以促进骨折修复和骨缺失治疗。
3. 心脏病学：组织工程技术可以用于开发心脏起搏器和心脏瓣膜器械。
4. 肝脏病学：组织工程技术可以应用于肝细胞治疗和肝部手术。
5. 神经学：组织工程技术可以开发用于治疗神经退行性疾病、头部损伤和脊髓损伤的技术。
组织工程技术的原理组织工程技术是一项复杂的交叉学科研究。
为了成功地重新生长组织，组织工程师必须考虑到一系列的因素，包括生物相容性、细胞培养、支架结构和物理条件等。
一般来说，组织工程技术可以分为以下几个步骤：1. 细胞的提取：组织工程师首先需要从患者体内提取细胞，并进行细胞培养。
这些细胞可以来源于外周血、骨髓、胚胎或干细胞等。
2. 生物支架的开发和制备：组织工程技术需要使用支架，以为细胞提供一个适宜的环境。
支架可以是合成的，也可以是基于天然材料制备的。
在支架的设计过程中，组织工程师需要考虑到支架的孔隙性、生物交换性和机械性能等。
3. 组装支架：在细胞和支架材料都准备好后，组织工程师需要把细胞种植到支架之中，在相应的生理条件下进行细胞培养。
4. 查看细胞的生长情况：通过生物学和力学的分析，使支架对组织细胞具有足够的生物相容性和生物功能，同时还要满足有关环境。
组织工程在脊柱修复中的研究进展
组织工程在脊柱修复中的研究进展脊柱是人体的重要支柱，它不仅支撑着身体的重量，还保护着脊髓和神经根等重要结构。
然而，由于创伤、疾病或退行性变等原因，脊柱可能会受到损伤，导致疼痛、功能障碍甚至残疾。
传统的治疗方法如脊柱融合术、脊柱内固定术等虽然在一定程度上能够缓解症状，但也存在一些局限性，如融合节段活动度丧失、相邻节段退变加速等。
近年来，组织工程技术的发展为脊柱修复带来了新的希望。
组织工程是一门融合了生物学、工程学和医学的交叉学科，旨在通过构建生物活性材料、细胞和生长因子的复合物，修复或替代受损的组织和器官。
在脊柱修复领域，组织工程技术主要应用于椎间盘修复、脊柱骨修复和脊柱韧带修复等方面。
椎间盘是脊柱中连接相邻椎体的重要结构，它由髓核、纤维环和软骨终板组成。
椎间盘退变是导致腰痛的常见原因之一。
组织工程椎间盘修复的策略主要包括细胞治疗、生物材料支架构建和生长因子应用等。
细胞治疗是将具有分化潜能的细胞植入椎间盘内，促进椎间盘细胞的再生和修复。
常用的细胞类型包括髓核细胞、纤维环细胞、间充质干细胞等。
研究表明，间充质干细胞具有多向分化潜能和免疫调节作用，在椎间盘修复中具有良好的应用前景。
然而，细胞治疗面临着细胞存活、分化和功能整合等诸多挑战。
生物材料支架在椎间盘修复中起着重要的支撑和引导作用。
理想的椎间盘支架应具有与椎间盘相似的生物力学性能、良好的生物相容性和孔隙结构，能够支持细胞的黏附、增殖和分化。
目前，研究较多的支架材料包括胶原蛋白、聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）、壳聚糖等。
此外，一些新型的生物材料如丝素蛋白、水凝胶等也在不断涌现。
生长因子如转化生长因子β（TGFβ）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等能够调节细胞的增殖、分化和基质合成，在椎间盘修复中具有重要作用。
然而，生长因子的应用存在剂量控制、半衰期短等问题，需要进一步研究解决。
脊柱骨修复是脊柱组织工程的另一个重要研究方向。
脊柱骨折、脊柱肿瘤切除等情况常导致脊柱骨缺损，需要进行修复重建以恢复脊柱的稳定性。
综述组织工程支架修复脊髓损伤的研究进展
・综 述・组织工程支架修复脊髓损伤的研究进展蒋 涛综述 任先军审校作者单位:第三军医大学附属新桥医院骨科重庆400037电话:(023)68774908 E 2mail:fr omcq2000@sina .com 脊髓损伤(Sp inal Cord I njury,SC I )是骨科领域致残率、死亡率最高的创伤之一,人们不断努力探索神经元轴突再生机制,试图找到有效的治疗方法。
目前,治疗S C I 的主要策略有:挽救受损神经元,减少其发生迟发性损伤和凋亡;应用刺激神经生长的因子和/或阻断抑制轴突生长和延伸物质的作用,促进受损轴突的再生;组织或细胞(外周神经、胚胎脊髓、神经干细胞、神经胶质细胞等)移植诱导轴突再生和细胞分化。
他们对修复SC I 起到了很大作用,但尚无根本突破。
近年来,运用组织工程支架修复SC I 的新思路已日益受到人们重视。
1 SC I 研究的现状作为中枢神经系统,脊髓是一个由大量神经元和神经纤维精确连接构成的三维立体网络系统,具有复杂的结构。
SC I 会直接导致神经元坏死、神经纤维中断,继而引发包括炎症反应、缺血损伤、各种毒性物质大量释放、神经元凋亡等一系列复杂的病理生理学变化,脊髓结构严重破坏。
而SC I 区轴突再生却又存在诸多困难,如:髓鞘抑制蛋白、胶质瘢痕等神经再生抑制因素的存在,多种神经营养因子缺乏等。
此外,SC I 修复不同于其它组织,要求极高,必须重建轴突与靶细胞间的精确连接才有根本意义。
种种复杂因素为修复SC I 的研究带来了巨大挑战。
当前SC I 的各种治疗策略均不能达到理想效果。
其中存在的问题有:神经元凋亡机制尚未完全弄清,外源性应用神经营养因子难以持续恒定起效,而细胞移植在移植部位缺少支持基质,其作用难以充分发挥,此外,如何抑制胶质瘢痕的生成也是难以突破的瓶颈。
SC I 治疗研究需要另寻出路。
2 修复SC I 组织工程学理念近年来,许多学者已经意识到单一依靠某种细胞或神经营养因子不可能彻底解决SC I 治疗中所遇到的问题。