实验九质粒DNA的制备
质粒DNA制备
另外，HB101及其它含有endA+基因型 的菌株表达中的核酸内切酶A，在煮沸 时不能完全失活， 在以后操作中， 只要有Mg2+存在(如内切酶反应缓冲液)， 核酸内切酶A就可将质粒DNA降解，而 影响实验结果。
若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒 DNA，不管是大量还是小量制备，必须 用酚、氯仿反复抽提几次．以去除该 酶．
半乳糖苷酶
X-gal
X + gal
无色
蓝色产物 半乳糖
若在含有X-gal的培养剂中，在乳糖操纵 子(lac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷 (isopropylthiogalactoside，IPTG)的作 用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X—gal， 此菌落成为蓝色。
若lacZ基因被外源DNA片断插入而破坏， 则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。
6. 限制性内切酶单一切口
在质粒复制子以外的部位具有一种或多 种限制性内切酶的单一切口，便于外源 基因的插入。
若这种单一的限制性内切酶位点处于选 择标记基因的内部，外源基因片断插入 后会导致该基因失活便于筛选。
三、常用质粒载体
1. pBR322
pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长 为4 363bp，由3种野生型质粒成分组成， ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl01， 复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号， 以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一个核 苷酸。
在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在 另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒 却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数 的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代 中可含有两种质粒中的任意一种，但不会 兼而有之。
通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能 力，可以把它们分为若干不相容组。带有 相同复制子的质粒属于同一不相容组，而 带有不可互换成分的复制子的质粒则属于 不同的不相容组。现已发现30多个这样的 不相容组。
质粒dna的提取步骤
质粒dna的提取步骤质粒DNA的提取步骤质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌中自主复制。
质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯化质粒。
在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。
材料和试剂：1.细菌培养物2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）4.醇5.异丙醇6.以太7.加拿大CFII列的紫外灯8.恒温振荡器步骤：1.收集培养物将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。
通过离心将细胞沉淀到离心管底部。
2.细胞溶解添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破细胞壁。
将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。
3.移除细胞碎片离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至另外的离心管。
4.蛋白酶K处理向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。
5.沉淀DNA的制备离心管离心2分钟，然后将上清倒出。
沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。
离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。
6.沉淀物最佳溶解将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥发。
将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。
7.检测提取的DNA通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。
通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告实验目的：本实验旨在通过提取细菌质粒DNA，了解细菌质粒的结构、基因组成和使用纯度较高的质粒DNA的重要性，为后续分子生物学实验打下基础。
实验器材：- 细菌- LB液体培养基- 1.5mL微量离心管- 离心机- 动态温度水浴仪- 恒温振荡器- 超声波清洗器- 洁净平台和无菌技术用品- 始终细切割刀和取样刷- 蒸馏水、2% SDS、醋酸铵、90%乙醇、异丙醇和干燥机实验步骤：1. 制备细菌：在LB液体培养基中培养要提取质粒DNA的细菌，由于质粒DNA在对数生长期达到最高含量，因此在显微镜下观察到对数生长期的细菌时进行取样。
2. 细胞打破和溶解质粒：离心细胞，倒去培养基，加入10mL蒸馏水，用振荡器在4℃下以300rpm摇晃3小时。
然后沉淀细胞，在70℃下干燥30分钟。
随后加入150μL1%SDS和其他化学试剂混合物，使用至少15次的起始细切割刀切成绒毛状的颗粒，浸泡在低盐度醋酸铵中2小时以上。
3. 质粒DNA纯化：将浸泡了细菌绒毛颗粒的混合物离心，抽取上清液，将其加入2x体积的异丙醇与等体积的75%，然后用再生明胶抑制蛋白质在异丙醇中凝聚。
离心，除去异丙醇上清液，加入70%乙醇洗涤。
最后用干燥机吸干。
4. 质量分析：分析提取到的质粒DNA的浓度和纯度，使用分光光度计对其进行光谱分析，以检测质粒DNA的A260/A280比例和A260/A230比例。
通过比较纯度，然后将质粒DNA冻保存至-20℃或-80℃。
实验结论：本实验成功提取了细菌的质粒DNA，并进行了纯化和分析。
质粒DNA的提取和纯化是基于一系列物理和化学方法和技术的，实际操作中需要仔细操作，耐心等待，严格注意洁净操作，才能达到最佳的提取和纯化效果。
通过本实验，我进一步了解了在分子生物学和遗传学中质粒DNA的重要性，它可适用于多种研究项目和应用，例如质粒克隆、基因编辑、基因表达、和质粒蛋白质互作等。
质粒dna的提取及电泳检测实验报告
质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。
二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。
电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。
三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。
2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。
3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。
4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。
5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。
四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。
五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。
实验九 质粒提取与电泳
实验要求 每组同学看到质粒条带 估算出质粒条带的分子量大小
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析
实验报告
下次实验
• 病毒的鸡胚接种、血凝和血凝抑制试验
将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在57mm之间。 凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将胶移至装 有1×TAE–buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且 使缓冲液没过胶面。
取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液混合后，用 微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。
盖上电泳槽盖并通电，使DNA向阳极移动。
二、宿主的基本要求与性质
①能够高效吸收外源DNA ②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统 ③不具有限制修饰系统
④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-） ⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖 ⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害 或无致病性等
三、碱裂解法制备质粒DNA
注意点：使用酚－氯仿时注意安全
（11）小心吸去上清液，将离心管倒置灭菌水，用枪头吹打沉淀，使其 彻底溶解，取9μl的DNA样品进行琼脂糖电泳， 其余-20℃保存备用。
实验操作- -质粒DNA电泳
透明胶封固样品槽两头，在一端放置样品梳。
用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1×TAE–buffer)，在微波炉中加热至琼 脂糖溶解。待溶液冷却至60℃，加入适量溴化乙锭 至微红，混匀。
（8）加等体积的溶液Ⅵ，振荡、颠倒离心管几次以沉 淀DNA，于室温放置２分钟，小心吸取上层水相至另一 洁净的离心管中。
质粒dna的制备实验报告
质粒dna的制备实验报告质粒DNA的制备实验报告引言：DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的重要分子。
质粒DNA是一种环状的双链DNA分子，广泛存在于细菌和其他一些原核生物中。
质粒DNA具有自主复制的能力，并携带了一些对细菌有益的基因信息。
因此，质粒DNA的制备对于基因工程研究和生物技术应用具有重要意义。
实验目的：本实验旨在通过离心、溶解、酶切及纯化等步骤，制备出高纯度的质粒DNA样品。
实验材料与方法：1. 细菌培养液：含有目标质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心沉淀细菌。
3. 离心机：用于离心沉淀细菌和质粒DNA。
4. 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解所需的缓冲盐和酶切酶。
5. 酶切酶：用于切割质粒DNA。
6. 蛋白酶K：用于降解细胞中的蛋白质。
7. 酚/氯仿：用于提取DNA。
8. 异丙醇：用于沉淀DNA。
9. 纯化缓冲液：用于纯化DNA样品。
实验步骤：1. 收获细菌：将培养液离心10分钟，将菌体沉淀收集至离心管中。
2. 细胞裂解：加入适量的细胞裂解缓冲液，使菌体充分裂解，并加入蛋白酶K降解蛋白质。
3. DNA提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇动离心管使两相混合，离心分离上下两相。
4. DNA沉淀：将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇动离心管使DNA沉淀。
5. DNA纯化：将DNA沉淀洗涤至纯化缓冲液中，离心沉淀DNA，去除上清液。
6. 测定DNA浓度：使用比色法或荧光法等方法测定DNA的浓度。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功制备出了高纯度的质粒DNA样品。
通过测定DNA浓度，我们可以得到质粒DNA的含量。
实验中使用的细菌培养物中含有目标质粒DNA，经过细胞裂解和酶切等步骤，我们成功地将质粒DNA从其他细胞组分中分离出来。
酚/氯仿提取和异丙醇沉淀的操作使得DNA得以纯化和浓缩。
最后，使用纯化缓冲液洗涤和离心沉淀，去除上清液，进一步提高了DNA的纯度。
质粒dna的碱法大量制备,实验报告
质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。
）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。
）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。
注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。
b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。
3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。
注：最后菌液的OD600值应为0.4。
由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
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二 质粒提取
1. 取1ml培养物倒入 Eppendorf 管中，4000-5000r/min，5min 2. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 3. 将细菌沉淀悬浮于150μl溶液Ⅰ中，振荡混匀。 4. 加入150μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，
室温放置5分钟。 5. 立即加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 6. 12000r 4 ℃离心10分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管
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三．实验方法
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到培养基上（活化菌种），37℃过 夜培养
2. 从培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含 氨苄），37℃振荡过夜培养
3. 从中取4毫升种子菌液于LB培养基中（含Amp），37℃振荡 培养3-4小时
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2.严紧型质粒
严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成 抑制剂来增加。
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质粒的应用
大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒
害致死的基因。
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
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碱变性法基本原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
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试剂
溶液Ⅰ： 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA
溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS
溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml
(酚/氯仿)，异丙醇, 乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA
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pUC19
链长2,686 bp 多克隆位点：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I,
Sal I, Pst I, Sph I 和Hind III 只有一个酶切位点。 用途 克隆外源基因。 利用lac promoter进行基因表达。 使用M13 primers进行DNA测序。
中。
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7．加入等体积异丙醇，振荡混匀，于室温静置5分 钟,12000r 4 ℃离心15分钟。
8．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数 次，8000r 于离心5分钟。
9．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。
10．加入20μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解 DNA。
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分离质粒DNA方法
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法；
煮沸法；
SDS法； 羟基磷灰石层析法等
各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化。
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本实验目的实ຫໍສະໝຸດ 四 碱变性法小量制备质粒 DNA可编辑版
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一．实验目的及背景
质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。
大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。
其复制和遗传独立于细菌染色体。
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质粒类型
质粒按复制方式分为两种类型： 1.松弛型质粒
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋 白。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依 然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色 体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷 贝数可达 2000-3000 拷贝。
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问题与讨论：
１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作 用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应 体系出现的现象及其成因。
２．染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据 是什么？
3. 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高 盐、低温条件下进行？
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