循环肿瘤DNA在临床应用中的研究进展_许婷
循环肿瘤DNA在结直肠癌中的临床应用及研究进展
近年来,随着生活环境和方式的改变,我国结直肠癌的发病率越来越高,年轻化趋势也越来越明显。
据数据统计[1],2015年我国结直肠癌新发病例376300人,死亡人数19100人。
如果能早期确诊,检测基因突变,指导用药,动态实时监测肿瘤复发和转移,这对于提高患者生存率、改善预后有非常大的价值。
组织病理活检是确诊肿瘤的金标准,但其反映的是肿瘤在某一时间点的状态,不能动态监测肿瘤的改变,且组织活检是一种有创手段,可能会使患者出现相应的并发症。
因此,无创且能实时监测肿瘤进展的“液体活检”技术应运而生,循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)检测即其中的一种。
循环肿瘤DNA不仅可作为结直肠癌的一种生物学标志物,还能监测出基因突变情况,预测结直肠癌的复发与转移,进行疗效和预后评估,对早期诊断、改善患者预后有重要价值。
本文就ctDNA在结直肠癌中的临床应用及研究进展作一综述。
1ctDNA的来源与特性1948年,Mandel和Métais在外周血中发现存在大量的降解的DNA片段,称为循环游离DNA(circu⁃lating free DNA,cfDNA)[2],主要来自于坏死或凋亡的细胞,片段长度集中在180~200bp,可在血液、尿液、痰液、脑脊液、滑膜液、粪便中被检测到。
数十年后,人们发现了循环肿瘤细胞DNA(ctDNA),是指由肿瘤细胞脱落或者凋亡后释放到血液循环系统中的双链DNA片段。
ctDNA为cfDNA的一部分,ctDNA只来源于肿瘤细胞,而cfDNA既可来源于肿瘤细胞也可来源于正常细胞。
虽然ctDNA由肿瘤细胞凋亡后释放,但其在肿瘤患者体内的含量很低,约占整个cfDNA的1%,甚至只有0.01%[3]。
同时,其半衰期也很短,只有大约2h。
相关研究表明[4],ctDNA的遗传突变信息来自于肿瘤细胞的体细胞突变,故ctDNA所携带的肿瘤相关信息与肿瘤组织具有一致的生物学特性。
循环肿瘤细胞检测在乳腺癌患者中的应用研究进展
循环肿瘤细胞检测在乳腺癌患者中的应用研究进展
循环肿瘤细胞是从原发肿瘤中脱落的癌细胞，进入血液循环并迁移到远离原发灶的其他器官。
通过检测CTCs的存在和数量，可以提供乳腺癌的早期诊断、预测预后、指导治疗和监测疗效的重要信息。
目前，乳腺癌患者中CTCs检测的主要方法包括免疫细胞化学染色、流式细胞术、聚合酶链反应和原位杂交等。
这些方法具有各自的优缺点，但可以在不同的检测阶段识别和分离CTCs，并对其进行进一步的分析和研究。
近年来，许多研究表明，在乳腺癌患者中检测到的CTCs与肿瘤的临床特征和预后密切相关。
CTCs的存在和数量与患者的淋巴结转移、肿瘤大小、分子亚型和基因突变等因素相关。
一些研究发现，在治疗前和治疗后检测CTCs的变化可以作为预测患者治疗效果和预后的生物标志物。
除了CTCs的数量，一些研究还对CTCs进行了进一步的分析，包括CTCs的表型、单个细胞基因分析和表观遗传学分析等。
这些研究不仅可以帮助我们了解CTCs的生物学特性，还有助于发现新的治疗靶点和预测患者的治疗反应。
虽然循环肿瘤细胞检测在乳腺癌患者中的应用研究取得了一些进展，但仍然面临着一些挑战。
由于CTCs的数量很少且易被检出，检测的灵敏度还有待提高。
标准化的CTCs检测方法和操作流程尚未建立，不同研究结果之间的比较和验证存在一定的困难。
长期的随访和大样本的临床研究仍然需要进行，以验证CTCs作为预测患者预后和指导治疗的可行性和准确性。
循环肿瘤细胞作为乳腺癌患者的生物标志物，具有重要的临床应用价值。
随着技术的不断发展和研究的深入，循环肿瘤细胞检测有望成为乳腺癌早期诊断和治疗个体化的重要手段。
循环肿瘤细胞研究进展
循环肿瘤细胞研究进展循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是指肿瘤细胞在血液中的存在形式，是肿瘤细胞迁移和转移的重要媒介。
随着一系列识别和分离方法的发展，CTCs被广泛应用于肿瘤诊断、预后评估、疾病监测和治疗效果评估等领域，成为肿瘤研究的热点之一。
本文将介绍循环肿瘤细胞研究的最新进展。
CTCs的分离和检测是CTCs研究的基础。
近年来，随着分子生物学、生物芯片技术的发展，研究人员提出了许多新型的CTCs分离和检测方法，如基于肿瘤细胞表面标记的免疫磁珠分离、微纳米技术的微滤装置、电化学生物传感器等。
这些方法能够高效、特异地分离和检测CTCs，极大地提高了CTCs的检测灵敏度和准确性。
CTCs的生物学特性研究是CTCs研究的重点之一。
CTCs具有高度异质性，不仅表现出肿瘤细胞的生物学特性，还表现出其自身的特殊生物学行为。
研究发现，CTCs与致瘤性、药物敏感性、肿瘤转移等密切相关。
例如，CTCs能够主动进入血液循环，并在其余器官种植形成转移瘤；CTCs具有更高的DNA 损伤修复能力，能够抵抗化疗药物导致的DNA损伤；CTCs还能够通过与免疫系统的相互作用来逃避宿主免疫系统的攻击、促进肿瘤迁移等。
这些发现为CTCs的临床应用提供了强有力的支持。
CTCs的临床价值研究是CTCs研究的一个重要方向。
研究发现，CTCs在肿瘤的诊断、治疗和预后评估等方面具有广泛的临床应用。
例如，在肿瘤早期诊断方面，CTCs成为一种新的检测手段，不仅能提高癌症早期检测的准确度，而且能明显增加肿瘤后随访的预测价值。
在肿瘤治疗方面，CTCs不仅能够作为肿瘤预后评估的一种生物标记，还可以帮助肿瘤医生制定更精确的治疗方案。
在疾病监测方面，CTCs几乎可以实时监测治疗效果和疾病进展情况，因此被视为一种有效的治疗效果监测手段。
总之，CTCs的研究取得了长足的进展，不仅深化了对CTCs 生物学特性的认识，而且广泛应用于肿瘤诊断、治疗和预后评估等领域，为更好地促进肿瘤的治疗和控制提供了新思路和新方法。
循环肿瘤DNA的检测及临床意义护理课件
循环肿瘤DNA检测在肿瘤患者护理中的应用实例
乳腺癌患者
通过检测循环肿瘤DNA，可以监 测乳腺癌患者的病情变化，及时 调整治疗方案，提高治疗效果。
结直肠癌患者
对于结直肠癌患者，通过检测循 环肿瘤DNA，可以早期发现微小 转移灶，提高治愈率。
循环肿瘤DNA检测在肿瘤患者护理中的注意事项
样本采集
采集血液样本时，应确保 采血管清洁、干燥，避免 交叉污染。
感谢观看
循环肿瘤DNA检测在肿瘤患者护理中的意义
01
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辅助诊断
通过检测循环肿瘤DNA， 可以早期发现肿瘤的存在 ，提高诊断的准确性。
监测病情
循环肿瘤DNA的浓度和肿 瘤的发展、转移和复发密 切相关，可以用于监测病 情变化。
指导治疗
通过检测循环肿瘤DNA， 可以了解肿瘤的基因变异 情况，为制定个体化治疗 方案提供依据。
检测方法
选择灵敏度高、特异性好 的检测方法，确保结果的 准确性。
结果解读
对于检测结果，应由专业 医生进行解读，避免误判 和漏判。
04
循环肿瘤DNA检测的未来展望
循环肿瘤DNA检测技术的发展趋势
检测技术不断优化
随着生物技术的不断进步，循环 肿瘤DNA的检测技术将更加精准 、灵敏，能够检测更低浓度的肿
瘤DNA。
检测范围扩大
未来循环肿瘤DNA的检测范围将 进一步扩大，不仅限于癌症诊断 ，还可能用于疗效评估、复发监
测以及个性化治疗等方面。
联合多种检测手段
循环肿瘤DNA检测将与其它肿瘤 检测手段如影像学、组织病理学 等相结合，形成更为全面的肿瘤
诊断体系。
循环肿瘤DNA检测在临床护理中的前景
个性化治疗指导
癌细胞循环肿瘤DNA检测技术研究进展
癌细胞循环肿瘤DNA检测技术研究进展癌症是当前全球范围内最为常见的一种致命疾病，也是导致死亡的主要原因之一。
早期发现和诊断癌症对于患者的治疗和生存率有着重要的影响。
然而，传统的肿瘤检测方法往往依赖于组织活检或者特定区域的检测，这些方法存在不便、创伤性和局限性等问题。
而近年来，癌细胞循环肿瘤DNA （ctDNA）检测技术的出现，为早期癌症的诊断和治疗提供了新的思路和机会。
癌细胞循环肿瘤DNA是指在癌症患者的体内通过血液循环而来的肿瘤细胞释放的DNA片段。
随着肿瘤的生长和发展，肿瘤细胞会释放大量的DNA进入体液中，而这些片段可以通过血液样本进行检测和分析。
相对于传统的组织活检，ctDNA检测技术具有非创伤性、实时性、动态监测等优点。
基于ctDNA的检测技术可以帮助医生在早期发现肿瘤细胞在身体中的存在，并且预测肿瘤的恶性程度、治疗效果以及预后等信息。
在过去的几年里，关于ctDNA检测技术的研究取得了一系列的突破和进展。
首先，随着高通量测序技术的发展，研究者们能够对体液样本中的ctDNA进行全面而高效的检测。
通过测序分析，可以检测到癌症相关的具体突变、基因重排和基因组变异等，从而为早期癌症诊断提供了更准确的依据。
其次，人工智能和机器学习技术的应用使得对ctDNA数据的处理和分析变得更加高效和精确。
科学家们可以通过构建相应的模型来预测疾病的进展和治疗效果，从而为患者提供个性化的治疗服务。
此外，研究者们还在不断探索如何提高ctDNA的检测灵敏度和特异性。
一方面，通过设计更加精准的引物和探针，可以选择性地捕获和扩增ctDNA，提高其在样本中的检测信号。
另一方面，通过利用微流控芯片和纳米技术等先进技术，可以实现对ctDNA的高效富集和检测，进一步提高其检测的敏感度。
同时，结合多种技术手段，如液体活检、基因突变分析和全基因组测序等，可以更全面地了解肿瘤的遗传特征和异质性，为精准治疗提供更有效的依据。
目前，ctDNA检测技术已经在临床实践中得到广泛应用，并取得了一些重要的研究进展。
循环肿瘤DNA检测在乳腺癌诊断中的临床应用
循环肿瘤DNA检测在乳腺癌诊断中的临床应用叶青，江泽飞军事医学科学院附属医院乳腺肿瘤科随着二代测序技术的发展，循环肿瘤DNA（ctDNA）检测在乳腺癌中的应用得到越来越多的关注。
目前国内外大量研究显示ctDNA检测技术在监测肿瘤负荷、疗效预测、早期诊断、预后分析等方面具有广阔的应用价值。
在乳腺癌诊疗走向个体化精准的时代，ctDNA检测能够为患者提供更为精准的诊断，指导临床治疗。
早在1948年，Mandel和Metais就在人的血浆中检测出细胞外游离DNA的存在，由此拉开了游离DNA研究的序幕；1965年，Bendich的团队发现肿瘤与循环游离DNA（cfDNA）存在相关性；1977年，Leon等人通过放射免疫测定法对比了正常人和肿瘤患者血中游离DNA的表达，表明血中游离DNA水平与肿瘤病程及疗效相关；随后更多证据表明血中游离DNA与原发肿瘤基因突变存在一致性【1】；2010年，García-Olmo等【2】的研究确定了游离DNA的致癌性。
近几年循环DNA的研究已成为癌症诊断的热门研究领域，在肿瘤负荷监测、药物疗效预测、复发转移监测、早期诊断及预后分析等方面具有潜在的临床应用价值。
1 循环肿瘤DNA（ctDNA）1.1 cfDNA与ctDNAcfDNA是由正常细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞等凋亡、坏死后释放到血管中的游离的DNA片段组成的。
这些DNA片段通常与蛋白质结合形成核小体游离于循环中【3】。
其中ctDNA特指能够反映肿瘤基因组信息的cfDNA【4】。
关于ctDNA的释放、降解机制目前尚无定论。
目前认为，ctDNA 来源于坏死、凋亡的肿瘤细胞，或是肿瘤细胞的外排体【5】。
而ctDNA的降解可能与肝脏和肾脏代谢相关，根据不同DNA片段大小、结构其半衰期差异较大，范围从10min至2h不等。
1.2 ctDNA的检测优势及困难组织学活检能够提供疾病的初始状态，为疾病的诊断、治疗提供重要的信息。
循环肿瘤DNA的检测技术及其临床应用
循环肿瘤DNA的检测技术及其临床应用近年来，随着肿瘤治疗的不断深入，循环肿瘤DNA （circulating tumor DNA，ctDNA）的检测逐渐引起了人们的关注。
ctDNA是肿瘤细胞在血液中释放的DNA片段，通常是短片段（150-200 bp）的双链DNA，其含量较低且易被血液中其他DNA污染。
然而，通过优化实验条件和测序技术，目前已经可以对ctDNA进行有效和准确的检测，并且已有广泛的临床应用。
一、循环肿瘤DNA的检测技术目前，检测ctDNA的技术主要包括数字式PCR（digital PCR）、酶联免疫吸附法（ELISA）、多重热融曲线分析（MCA）、放射化学发光检测（RCA）和下一代测序（NGS）等。
数字式PCR是目前最常用的技术之一。
它采用微小反应体积，将DNA分散于许多单独的小区域进行扩增，可以检测出非常低的DNA量。
与传统PCR技术相比，数字式PCR可以准确地定量ctDNA，其检测灵敏度可达0.01%。
另一种常用的ctDNA检测技术是ELISA。
该技术利用针对肿瘤特异性标志物的抗体，可准确鉴定ctDNA中的癌细胞来源。
然而，它的灵敏度和特异性相对较低，只能用于筛查。
MCA可以检测ctDNA的序列特征，因此，它可以在PCR扩增的同时，对不同的DNA序列进行鉴定。
与数字式PCR相比，MCA可以检测较长的DNA片段，适用于较大的目标基因区域或全基因组分析。
RCA是一种新型的扩增技术，可将单个DNA分子扩增到可见的DNA量，并可检测非常低的DNA含量。
RCA对ctDNA纯化和富集效果较好，因此被广泛用于肿瘤的早期筛查和诊断。
NGS是一种高通量测序技术，对肿瘤的品种和类型进行快速和精确的鉴定。
同时，它还可以检测各种基因突变和结构变异，为肿瘤治疗提供参考。
二、循环肿瘤DNA的临床应用ctDNA是肿瘤细胞释放的DNA片段，它在诊断、预后评估和治疗监控等方面具有广泛的应用。
1．诊断：对于那些无法或难以取得实体肿瘤组织的肿瘤复发病例，循环肿瘤DNA的检测可以为肿瘤复发提供准确的证据。
免疫治疗中的非常规应答模式及评效标准
免疫治疗中的⾮常规应答模式及评效标准许婷a，冯艾薇a 翻译；王晰程a,b 审校a 北京⼤学肿瘤医院消化肿瘤内科；b 中国临床肿瘤学会（CSCO）翻译⼩组摘要：研究发现免疫治疗有着不同于传统的细胞毒药物治疗和靶向治疗的肿瘤应答和进展模式。
免疫治疗的重⼤突破在于对⼀部分晚期肿瘤患者即使在停⽌免疫治疗后仍能够维持持续的疗效。
⽂献对持久应答还没有标准化定义，产⽣持久应答需要达到的治疗时间也尚不清楚。
但是，免疫治疗对⼤部分患者是⽆效的。
早期研究在进展期⿊⾊素瘤的患者中发现存在假性进展，也就是在肿瘤增⼤之后出现病灶的缩⼩，这⼀发现⽀持我们在⼀部分患者即使出现了疾病进展也可以继续应⽤免疫治疗。
总体来说，假性进展出现的⽐例不超过10%，这意味着免疫治疗对⼤部分出现疾病进展的患者是⽆效的。
进展后继续免疫治疗需要谨慎的选择⼀部分有临床获益且没有明显免疫治疗治疗相关毒副作⽤的患者。
相反地，⼀些研究团队报道了4%~29%的患者出现了超进展的现象。
这⼀现象还需要在随机对照临床试验中进⼀步证实。
超进展的患者需要及时终⽌免疫治疗并积极调整为其他可能有效的治疗⽅案。
最后，还有部分患者出现分离的应答反应，即部分病灶缩⼩，部分病灶增⼤。
对于增⼤的病灶可以考虑⼿术或者放疗等局部治疗。
为了更好地捕捉免疫治疗带来的获益，（研究⼈员）提出了⼀些新的免疫治疗专属的评效标准，但是这些标准适合评估假进展，但是对其他应答模式，例如超进展、分离式应答等的评价则存在缺陷。
（因此）经典的RECIST标准仍是临床上评价免疫治疗应答反应的合理有效⼯具。
关键词：免疫治疗，假性进展，进展后治疗，持久应答，超进展，应答评估引⾔包括抗CTLA-4、PD-1、PD-L1单抗在内的免疫检查点抑制剂（ICIs）是肿瘤学的重⼤突破，在多种晚期肿瘤的治疗中改善了患者的总⽣存期。
由于肿瘤细胞可以通过表达抑制性免疫检查点如CTLA-4或PD-1诱导免疫耐受，逃避肿瘤特异性T细胞的杀伤作⽤并导致疾病进展，于是研究⼈员希望通过抗CTLA-4或PD-1/PD-L1单抗特异性阻断这些免疫检查点从⽽激活抗肿瘤免疫应答。
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▲在读硕士研究生 △通信作者。E － mail： xiaogh66@ 163． com
理状态下，凋亡和坏死的细胞相对较少且细胞代谢缓慢。而 在肿瘤患者血浆中，cfDNA 释放增多，远超过核酸酶降解能 力以致不可避免地释放到血液循环中。近年来研究表明某 些临床状态可能会影响 cfDNA 的水平，如运动、终末期肾功 能衰竭、中风、心肌梗死、手术和创伤，结果提示 cfDNA 的水 平与细胞损伤或坏死有关。鲜有研究阐述 ctDNA 的稳定性， 因此我们对于血浆 cfDNA 的释放和代谢机制知之甚少。近 期提出，脾 脏、肝 脏、肾 脏 在 清 除 cfDNA 过 程 中 起 重 要 作 用［5］。妊娠妇女血浆游离胎儿 DNA 的清除半衰期仅为 16 min［6］，清除效率高速度快。
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广东医学 2015 年 10 月 第 36 卷第 19 期 Guangdong Medical Journal Oct． 2015，Vol． 36，No． 19
form of nitric oxide synthase［J］． Cardiovasc Ｒes，2013，99（ 4） ： 685 － 693． ［17］ QIU H，LIZANO P，LAUＲE L，et al． H11 kinase / heat shock protein 22 deletion impairs both nuclear and mitochondrial functions of STAT3 and accelerates the transition into heart failure on cardiac overload［J］． Circulation，2011，124（ 4） ： 406 － 415． ［18］ 杨官品，张蕾，董超华． 热休克蛋白 22 结构和功能研究进展 ［J］． 中国海洋大学学报： 自然科学版，2009，39 （ 5） ： 965 －
通过大量临床肿瘤试验的研究，ctDNA 作为液相活检的 功能逐渐被人们所认知。然而将液体活检正式用于临床实 践前需要大量前瞻性临床研究进行验证，且应对其分离检测 及分析过程的每个环节进行标准化。此外，ctDNA 释放的动 力学机制尚未完全阐明，所以在治疗过程中应检测同一癌症 患者不同时间 ctDNNA，而 原 发 性 脑、肾、前 列 腺 和 甲 状 腺 癌 患 者 不 到 50%［13］。该研究进一步分析了 206 例转移性结直肠癌患者 中与临床相关性高的 KＲAS DNA 突变基因，结果显示其敏 感性为 87. 2% ，特异性为 97. 2% 。CHUＲCH 等［14］检测无症 状结直肠癌患者的血浆中循环甲基化 SEPT9 DNA 发现了处 于不同分期的结直肠癌患者。同样类似的研究认为 DNA 甲 基化的测定可以判断晚期乳腺癌患者，并监测转移性乳腺癌 的肿瘤负荷及其治疗反应［15］。ctDNA 技术还可用于孕妇产 前诊断，孕早期的胎儿 cfDNA 不仅可以评估遗传性疾病，而 且能预测孕妇可遗传的癌症风险，如乳腺癌和卵巢癌，分别 可检测是否存在 BＲCA1 和 BＲCA2［16］。
4 ctDNA 的最新临床应用
随着新一代基因测序技术的发展，ctDNA 技术作为一种 快速、高效、非侵入性的检测肿瘤基因突变的“液相活检”将 运用于临床，主要可用于以下 3 个方面。 4． 1 ctDNA 用于癌症的早期诊断 近年来，循环生物标志 物在评估疾病严重程度方面起到重要作用，尤其是在影像学 结果不明确的情况下，如 PSA、CA19 － 9、AFP 和 CA － 125。 然而许多恶性肿瘤不具有可靠的蛋白质生物标记物，甚至在 有生物标志物的疾病中，这些标志物也常常缺乏特异性。此 外，大多数的蛋白质生物标志物在循环中持续存在数周，因 此要得到准确评估需等到数周或数月后［12］。而 ctDNA 的半 衰期短（ 约 2 h） ，可动态评估癌症情况［11］。并且 ctDNA 的肿 瘤特异性强，体细胞突变导致的癌症就是由于 ctDNA 取代了 相应的正常细胞 DNA。在一个 640 例大样本恶性肿瘤的研 究中，约有 75% 晚期胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、膀胱癌、 胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈部癌患者可检测到
广东医学 2015 年 10 月 第 36 卷第 19 期 Guangdong Medical Journal Oct． 2015，Vol． 36，No． 19
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酸活化的聚合反应） 和 TAM － Seq（ tagged － amplicon deep sequencing） 的出现大大提高了检测 ctDNA 的敏感性。Safe － SeqS（ Safe － Sequencing System） 技术可在极低的 cfDNA 浓度 下发现基因突变，并且可降低至少 70% 的误差率来提高准 确性。新一代基因测序（ NGS） 有助于血浆 ctDNA 的检测，可 在复发或病情恶化前进行早期预测，并且以 ctDNA － NGS 为 基础的分析方法可通过得知新兴突变片段而决策一个新的 治疗方案［10］。
（ 收稿日期： 2015 － 01 － 21 编辑： 庄晓文）
循环肿瘤 DNA 在临床应用中的研究进展*
许婷▲ ，肖国宏△
广州医科大学附属第三医院生殖医学中心、广东省生殖医学重点实验室、广东省产科重大疾病重点实验室、广州妇产科研究所 （ 广州 510150）
DOI:10.13820/ki.gdyx.20151013.009 近几年来，一 种 新 的 潜 在 肿 瘤 生 物 标 志 物 即 循 环 肿 瘤
1 ctDNA 的生物学特性 早在 1948 年 MANDEL［1］在正常人群的血液中检测到游
离 DNA 片段即血浆游离 DNA（ cell － free DNA，cfDNA） 。直 到几十年后，LEON 等［2］发现肿瘤患者体内 cfDNA 高于健康 个体，且晚期肿瘤患者 cfDNA 水平更高。这些研究提示 cfDNA 与肿瘤关系密切，并与肿瘤转移相关性高。随着研究的 不断深入，学者发现 cfDNA 中存在与肿瘤基因改变相同的 DNA 片段，并命名为 ctDNA。目前，ctDNA 的来源尚不十分 明确，但许多研 究 认 为 其 主 要 来 源 于 凋 亡 或 坏 死 的 肿 瘤 细 胞［3 － 4］。在肿瘤组织中，细胞代谢旺盛，肿瘤细胞可主动释 放 ctDNA 进入血液循环，并且转移病灶和循环肿瘤细胞也可 释放 ctDNA。大多数 cfDNA 片段在 180 ～ 200 bp 之间，cfDNA 被凋亡或坏死细胞释放到血液的浓度取决于肿瘤的位置、 大小和周围血管［3］。对于一个肿瘤负荷为 100 g（ 3 × 108 个 癌细胞） 的患者来说，每天将近 3. 3% 肿瘤 DNA 进入血液循 环［4］。因此，ctDNA 突变片段的比例与肿瘤负荷高度相关。 但 cfDNA 在循环中释放的动力学机制尚不清楚。在正常生
3 ctDNA 作为一种非侵入性的动态检测肿瘤指标的 临床应用
近年来，实施靶向治疗前大多需对肿瘤组织进行活检。 了解肿瘤组织的分子机制有助于随后的临床用药。当前肿 瘤病理组织活检仍是临床诊断的金标准，然而也是一种侵入 性检查。安德森癌症中心报道胸椎和盆骨的组织活检分别 会带来 17. 1% 和 1. 6% 的并发症［3］。此外，肿瘤 组 织 的 获 取、保存和肿瘤异质性使病理组织活检在一定程度上受到限 制。最新研究认为甲醛溶液石蜡包埋技术会影响 DNA 的分 子分析，且每个活检的样本中肿瘤细胞数与肿瘤细胞结构和 取样的大小及位置有很大关系［3］。因此，肿瘤病理组织活检 或组织切片可能遗漏瘤内其他部分的情况及转移瘤之间的 异质性。而 ctDNA 原则上可提供组织活检相同的遗传信息。 从患者血中分析 ctDNA，来源方便，损伤小，可动态监测癌症 治疗过程中每个阶段的基因组学和分子标志信息。据目前 研究 得 知，ctDNA 在 癌 症 Ⅳ 期 患 者 中 的 敏 感 性 几 乎 为 100%［11］，而在癌症微转移病灶的早期阶段 ctDNA 片段的检 测敏感性低［4］。因此鉴于这种新技术的优点和局限性，我们 需针对不同临床情况对 ctDNA 检测技术的灵敏度进行评估 并合理利用。
2 ctDNA 的检测
目前，检测和分析 ctDNA 的方法很多，但缺乏统一标准， 这在陈岳青等［7］研究 ctDNA 与非小细胞肺癌的关系中得到 进一步证实。因此我们需先解决一些问题。第一，分析前的 分离程序需 要 标 准 化。 首 先，收 集 样 品 到 分 离 血 的 时 间 间 隔，离心条件，确定用血清还是血浆分析； 然后，如何分离出 足够高质量的 DNA。第二，ctDNA 的定量标准化。量化的方 法包括分光光度计、荧光染料、定量 PCＲ 等。第三，cfDNA 的检测过程中存在 3 个难点，ctDNA 与正常 cfDNA 有何区 别、ctDNA 低水平状态如何检出和样品中突变片段数怎样准 确定量。研究显示虽然血清中 ctDNA 的量比血浆中高 2 ～ 24 倍，但血浆更适于用来分析 ctDNA，其原因可能是凝血过 程中细胞产生的某些物质影响分析［8］。cfDNA 发生基因突 变后称为 ctDNA，1994 年首次提出了 cfDNA 上的体细胞点 突变区域［9］。这些体细胞突变通常来源于单个碱基替换，只 在癌细胞或癌前的基因组细胞中存在，这保证了 ctDNA 作为 生物标记物的特异性。因此，肿瘤 DNA 片段丰富的癌症患 者的循环中，可以用标识体细胞突变 DNA 测序方法来明确 ctDNA。肿瘤细胞中核酸突变包括点突变、扩增、成排、DNA 甲基化、线粒体 DNA 突变以及非整倍体，其中以点突变发生 率最高，如 EGFＲ 和 KＲAS 突变。很多情况下，cfDNA 在循 环中浓度低且碎片率高，这给分析带来了巨大的挑战。随着 数字基因 组 技 术 的 发 展，数 字 聚 合 酶 链 反 应 技 术 （ Digital PCＲ） ，BEAMing（ beads，emulsion，amplification，and magnetics） ，PAP （ pyrophosphorolysis － activated polymerization，焦 磷