生物样品预处理技术
生物样品预处理
生物样品预处理的应用与发 展趋势
第六章
生物样品预处理的应用领域
医学领域：用于疾病诊断、治疗和 药物研发
环境监测领域：用于水质、空气和 土壤等环境因素的监测
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农业领域：用于农产品质量检测、 育种和病虫害防治
食品安全领域：用于食品添加剂、 农药残留和重金属等检测
生物样品预处理的发展趋势与展望
对于不同种类的生物样品，要分别 处理，避免交叉污染。
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在操作过程中，要遵循无菌操作原 则，避免微生物、细菌等污染样品。
在处理过程中，要定期对操作台、 器具等进行清洁和消毒，保持清洁 卫生。
保证操作的安全性
生物样品具有潜在危险，操作时应佩戴个人防护装备 遵循实验室安全规定，确保工作环境安全 避免交叉污染，确保生物样品处理过程中的安全 正确使用和处理化学品，确保操作的安全性
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实验要求：严格遵守操作规程，保 证实验结果的准确性和可靠性
实验步骤：按照操作规程进行实验， 记录实验数据并进行分析
检测方法与仪器
检测方法：生物样品预处理的方法应根 据检测目的和要求选择，常用的检测方 法包括光谱分析、色谱分析、质谱分析 等。
仪器选择：根据检测方法和生物样品的特 性，选择合适的仪器进行预处理，如离心 机、过滤器、萃取装置等。
仪器精度：仪器的精度对预处理结果的影 响较大，应选择精度高、稳定性好的仪器。
仪器维护：仪器的维护和保养也是影响 预处理效果的重要因素，应定期进行维 护和保养，确保仪器的正常运行和使用 效果。
操作人员技能与素质
生物样品预处理技术
取500g有代表性的猪肉可食部分，用组织捣碎机充 分捣碎均匀；
样品均匀化
取2g 捣碎样品，加入8ml乙酸钠缓冲液(pH=5.2)，再
• 固相萃取
• • • • • • • 操作： 活化 上样 淋洗 洗脱 收集 直接进样或者 浓缩后进样 与色谱理论相同
二、生物样品预处理方法
二、生物样品预处理方法
• 采用离心或者抽真空 的办法，以一定离心 力或者流速，进行上 样、淋洗和洗脱
二、生物样品预处理方法
• 固相萃取的优点：
• 无乳化现象 • 使用溶剂安全价格低廉
有机强酸
季铵碱、盐
有机酸、酚类
示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法
• A：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供 批号：03050803 • 3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷 Mr390 • • B：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供 • 2，3，5，4‘-四羟基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷 Mr406
• 萃取效率高
• 处理速度快，具有一定通量 • 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性 强的Ⅱ相代谢产物
• MCX固相萃取柱 • 反相作用和阳离子交换 作用
• 酸性环境中含氮碱性基 团与磺酸基结合 • 酸性药物呈分子状态发 生反相结合作用
对有机碱: 对有机酸、酚类 对有机强酸 对季铵碱、盐 pKa 2-8 pKa 2-10 pKa <1.0 pKa >10 选择 Oasis® MCX 选择 Oasis® WAX 选择 Oasis® WCX 选择 Oasis® MAX
• 储存条件
–20℃：大部分药物 –80℃：阿莫西林等抗生素 加稳定剂：卡托普利等
生物医药中的样品预处理技术
生物医药中的样品预处理技术生物医药领域涉及到的样品种类繁多，包括血液、尿液、组织、细胞等。
为了获得准确、可靠的分析结果，样品预处理技术尤为重要。
样品预处理技术可以从多个角度对样品进行处理，如去除游离离子、蛋白质除杂、化学修饰等手段，以达到分离分析所需成分的目的。
本文将介绍在生物医药领域中常用的几种样品预处理技术及其应用。
固相萃取技术固相萃取技术是一种简单、快速、高效的样品处理技术，通过选择不同的固相材料，可以实现分离不同的物质成分。
在生物医药领域中，固相萃取技术常用于样品前处理。
以血浆样品为例，血浆中含有大量的蛋白质、糖蛋白和酸性物质等，这些物质会影响后续质谱分析的灵敏度和准确度。
利用固相萃取技术可以去除这些有干扰的物质，提高质谱分析的准确性。
分离柱色谱技术分离柱色谱技术是将混合物经过柱色谱分离后得到所需成分的一种技术。
在生物医药领域中，分离柱色谱技术尤为重要。
比如在纯化一些特定的蛋白质时，可以通过离子交换、凝胶过滤等柱色谱方法，将目标蛋白质从其他杂质中分离出来。
此外，分离柱色谱技术还可以用于分离复杂的样品混合物，例如从组织中分离出细胞成分等。
电泳技术电泳技术是将静电场或电场作用于样品中带电的物质，在介质中由于电极力的作用而发生移动的技术。
在生物医药领域中，电泳技术最常用于蛋白质和核酸分析。
比如在核酸分析中，可以通过尺寸分离电泳的方法来区分DNA和RNA。
在蛋白质分析中，凝胶电泳技术可以将蛋白质按照其分子量从大到小排列，以此来分离和鉴定蛋白质。
磁珠分离技术磁珠分离技术是一种快速、高效的样品处理技术。
这种技术基于磁珠，通过在磁场作用下对样品中的物质进行有效、准确、快速的捕捉和分离。
在生物医药领域中，磁珠分离技术广泛用于核酸和蛋白质的纯化、富集和分离等过程。
此外，磁珠分离技术还可用于医学检测、组织修复和细胞分离等领域。
结语生物医药领域中的样品预处理技术是保证实验结果准确性和稳定性的重要环节。
本文介绍了固相萃取技术、分离柱色谱技术、电泳技术和磁珠分离技术等常见的样品预处理技术及其应用。
生化预处理工艺
生化预处理工艺生化预处理工艺是指在生物学和生物化学领域中，对生物样本（如细胞、组织、血液等）进行处理的一系列步骤。
这些步骤旨在提取、处理和保护生物样本中的分子、蛋白质、核酸等生物大分子，以便后续的分析、检测、测序或其他实验操作。
以下是一般的生化预处理工艺步骤：1.采集样本：生物样本的采集是整个生化预处理工艺的第一步。
样本的采集应当在符合规范的条件下进行，以确保后续分析的准确性和可靠性。
2.样本分离：样本中可能包含多种生物大分子，如细胞、细胞器、蛋白质、核酸等。
生化预处理的第二步是通过离心、过滤或其他分离技术将这些组分分离出来。
3.细胞破碎或组织破碎：对于细胞或组织样本，通常需要进行破碎以释放其中的细胞器、蛋白质和核酸。
这可以通过机械方法（如超声波破碎、刀具破碎）、化学方法（如酶解）或其他物理化学方法来实现。
4.提取蛋白质：对于蛋白质的分析，需要采用合适的提取方法。
这可能包括蛋白质沉淀、蛋白质抽提液（如RIPA缓冲液）等步骤，以得到可用于后续分析的蛋白质样品。
5.提取核酸：对于核酸（DNA、RNA）的研究，需要进行核酸的提取。
常用的方法包括酚氯仿提取、离心柱法、磁珠法等。
6.样本保存：在进行生化预处理后，样本需要以适当的方式保存，以防止生物大分子的降解。
通常使用冷冻、冷藏或添加保存液等方式。
7.测量和分析：处理后的生物样本可以用于各种分析，包括蛋白质电泳、质谱分析、核酸测序、PCR等。
8.数据解释和结果呈现：最后，通过对测量和分析得到的数据进行解释，并呈现最终的结果。
总体而言，生化预处理工艺是生物学和生物化学实验的基础，其质量和准确性对于后续的实验结果至关重要。
在进行生化预处理时，需要根据实验的具体目的和样本的性质选择合适的方法和步骤。
生物样品的采集制备和预处理
生物样品的采集制备和预处理生物样品的采集制备和预处理一、生物样品采集1、植物样品的采集（1）采集的植物样品要具有代表性、典型性、适时性。
（2）布点方法常采纳梅花形五点取样法或交叉间隔取样法。
（3）采样方法①采样前应预先准备好采样工具。
②依据实际情况确定样品采样量。
③选择优势莳植物在采样区内按梅花形五点或交叉间隔取样方式采集5－10处的植株混合构成一个代表样品。
④将采好的样品装入布口袋或聚乙烯塑料袋中，贴好标签，并填写采样登记表。
2、动物样品的采集（1）尿的采集定性检测尿液成分时应采集晨尿。
定量检测尿液成分时一般采集24h总排尿量。
（2）血液的采集一般用注射器抽取10mL血样冷藏备用。
常用于分析血液中所含金属毒物及非金属毒物。
（3）毛发和指甲的采集采集和保存较为便利，重要用于汞、砷等含量的测定。
（4）组织和脏器采集二、生物样品的制备对于液体状态的动物样品常无需制备，对动物组织和脏器重要是采纳捣碎的方法制成浆状鲜样备用，而对植物样常依据不怜悯况，利用不同方式进行样品制备。
植物样品的制备（一）平均样的获得四分法、切成块的1/4－1/8混合（二）分析试样的制备1、鲜样2、风干样：60－70摄氏度低温真空干燥箱中烘干（匀浆、小片）3、水分含量测定（100－105摄氏度烘干/真空干燥/低温烘干）三、生物样品的预处理常用的预处理方法有湿法消解法、灰化法、提取、分别和浓缩法等。
1、湿化消解法利用强酸等与生物样品共同煮沸，将样品中有机物分解成二氧化碳和水除去。
常用的消解试剂体系有浓硝酸－高氯酸、浓硝酸－浓硫酸、浓硫酸－过氧化氢等。
2、灰化法利用坩埚或氧燃烧瓶，使样品在高温条件下分解，并用适当的溶液溶解或汲取分解产物，制成分析试液。
3、提取法整个过程包括提取、分别、浓缩三个步骤。
（1）提取应依据样品的特点、待测组分的性质、存在形态和数量、分析方法等因素选择，常用方法有：1、振荡提取法2、组织捣碎提取法3、脂肪提取器提取4、直接球磨提取法（2）分别用提取剂从生物样品中提取欲测组分的同时，不可避开的会将其他相关组分提取出来，因此，在测定之前，还必需将上述杂质分别出去。
生物样品前处理方法
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起
来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
生物样品预处理
三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-参加与水相混溶的有机溶剂
操作步骤：
a.水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例 混合
b.离心别离，采用超速离心机〔10000r／
min〕离
将蛋白质粘牢在
管底，便于吸取
心1～2min。〔使用具塞上塑清液料尖底管〕
c.取上清液作为样品。
三、常用的处理方法-除蛋白法
111
0.87 沸点过高，调节极性用
55
0.74 含过氧化物
68
0.73 含过氧化物
35
0.71 含过氧化物
61
1.5 肝脏毒性，致癌作用
83
1.26
116
0.8
沸点过高，调节极性用
77
0.9
118
0.81 沸点过高，调节极性用
83
0.79
四、别离、浓集、纯化-液液萃取法
影响萃取的因素
2.有机溶剂相和水相的体积 a.有机相与水相〔体液样品〕容积比为1:1或
三、常用的处理方法-缀合物的水解
特点：多用于尿中药物或其代谢物；缀合物极性 较大，不易被有机溶剂提取。
常用方法：
a.酸水解：适量盐酸〔条件因药而异〕
b.酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或两者 的混合酶，一般控制pH值在～， 37℃培育数小时。
三、常用的处理方法-缀合物的水解
b.酶水解法
温和
专属性强
性盐 蛋白质沉淀
强酸
溶剂解 参加中
参加
三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-参加与水相混溶的有机溶剂 参加水溶性的有机溶剂，可使蛋白质分子内 及分子 间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋 白质结 合的药物释放出来。 常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙 醇、丙 醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血 清与水 溶性有机溶剂的体积比为1：〔1～3〕时， 就可以将
生物样品预处理的方法
生物样品预处理的方法一、生物样品预处理的重要性。
1.1 生物样品的复杂性。
生物样品那可是相当复杂的呀。
就拿血液来说吧，里面有各种各样的成分，像血细胞、血浆蛋白、各种离子、代谢产物等等。
这些成分混在一起就像一锅大杂烩，如果不进行预处理，想要准确分析其中特定的物质，那简直就是大海捞针，难上加难。
1.2 提高分析准确性。
预处理就像是给我们的分析工作打基础。
如果不把那些干扰的成分去除或者分离，分析仪器可能就会被误导。
比如说在检测血液中的某种药物成分时，如果血浆蛋白没有处理好，蛋白可能会包裹药物，导致检测到的药物含量比实际的少很多，这就会得出错误的结论。
所以预处理是让我们的分析结果更靠谱的关键一步。
二、常见的生物样品预处理方法。
2.1 蛋白质沉淀法。
这是一种比较简单粗暴但很有效的方法。
就像把混在沙子里的石子挑出来一样，我们通过加入一些试剂，像有机溶剂（如甲醇、乙腈）或者酸，让蛋白质沉淀下来。
这就好比给蛋白质使了个“定身术”，让它们从溶液里分离出来。
这样一来，那些被蛋白质包裹或者干扰的目标物质就能够更好地被检测到。
不过这种方法也有缺点，有时候会把一些小分子的目标物质也一起沉淀了，就像打扫卫生的时候不小心把有用的小物件也扫走了一样。
2.2 液液萃取法。
这就有点像油和水分离的感觉。
我们利用目标物质在两种互不相溶的溶剂中的溶解度差异，把目标物质从生物样品所在的溶剂中转移到另一种溶剂里。
比如说，我们要从血液的水溶液中提取一种脂溶性的药物，就可以加入一种有机溶剂，像氯仿，药物就会跑到氯仿层里，就像孩子找妈妈一样，然后我们把氯仿层分离出来，就得到了相对纯净的含有目标药物的溶液。
但是这个方法操作起来有点麻烦，就像走迷宫一样，要小心翼翼地确保每一步都准确。
2.3 固相萃取法。
这个方法可以说是比较高端大气上档次的。
我们把一种特殊的吸附剂装在一个小柱子里，然后让生物样品溶液通过这个柱子。
目标物质就像被磁石吸引一样，吸附在柱子里的吸附剂上，而那些杂质就流走了。
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对季铵碱、盐 对有机酸、酚类
pKa 2-10
pKa <1.0
pKa >10
pKa 2-8
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套用方法1
样品预处理
激活/平衡 上样
清洗: 2% 甲酸
淋出段 1: 100% MeOH
淋出段 2: 5% 氨℃：阿莫西林等抗生素 ✓ 加稳定剂：卡托普利等 ✓ 立即测试：维生素C等
一、生物样品的一般处理原则
• 生物样品均匀化
• 体液样品： 尿液、血浆——涡旋混匀
• 固体样品： 组织、粪便——加入适量溶剂进行高速匀浆
一、生物样品的一般处理原则
• 结合物水解
• 无乳化现象 • 使用溶剂安全价格低廉 • 萃取效率高 • 处理速度快，具有一定通量
• 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性 强的Ⅱ相代谢产物
• MCX固相萃取柱 • 反相作用和阳离子交换
作用
• 酸性环境中含氮碱性基 团与磺酸基结合
• 酸性药物呈分子状态发 生反相结合作用
对有机碱:
对有机强酸
中性物质
套用方法2
样品预处理
• Ⅱ相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物 • 极性大、亲水性、不易于提取富集
• 酸水解：简便、快速，不具备专一性，注意药物是否 被破坏
• 酶水解：β-葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时间 长，实验费用高
二、生物样品预处理方法
• 预处理的目的： 去蛋白，释放药物 样品纯化和富集 满足分析方法灵敏度的需要 防止分析仪器的污染和劣化 满足大量样品分析的需要 微量、快速
• 溶剂的选择与纯度的要求 • 有机溶剂相和水相的体积 • 水相的pH 值
二、生物样品预处理方法
• 常用的液液萃取溶剂：
❖ 正己烷
❖ 叔丁基甲醚
极
性
❖ 乙醚
增
❖ 乙酸乙酯
加
❖ 正丁醇*
• 相似相容原理进行选用
• 沸点低、易于挥散和浓集
• 不易乳化、不影响紫外检测
• 体积选择依实验考察
二、生物样品预处理方法
• 水相的pH值
• 水相pH值主要由药物的pKa确定 • 对于碱性药物最佳pH值要高于pKa值1～2个pH单位 • 对于酸性药物要低1～2个pH单位
• 碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质 中提取
• 血浆加入1M NaOH进行碱化后用适合溶剂提取
二、生物样品预处理方法
• 液液萃取的优点：
一、生物样品的一般处理原则
• 生物样品贮存 • 生物样品均匀化 • 结合物水解
• 生物基质的性质 • 测定对象的性质
一、生物样品的一般处理原则
• 生物样品的贮存
• 采集哪种生物样品：血浆、血清、全血、尿、组织…
✓ 血浆酯酶引起的水解——血浆样品—加入酯酶抑制剂 ✓ 微生物导致的腐败——尿液样品—加入防腐剂冷藏
二、生物样品预处理方法
• 固相萃取
• 操作： • 活化 • 上样 • 淋洗 • 洗脱 • 收集 • 直接进样或者
浓缩后进样
与色谱理论相同
二、生物样品预处理方法
二、生物样品预处理方法
• 采用离心或者抽真空 的办法，以一定离心 力或者流速，进行上 样、淋洗和洗脱
二、生物样品预处理方法
• 固相萃取的优点：
生物体内药物分析选论
生物体内样品及其预处理技术
生物体内药物分析的特点
常规药物分析：原料药物和药物制剂分析 真伪鉴别、纯度检查、含量测定 共存杂质、制剂辅料、复方药物
生物体内药物分析：复杂生物样品的微量分析 药物浓度低 样品采量少 干扰成分多
研究对象
• 血样 • 尿液 • 唾液 • 胆汁 • 组织器官
生物样品种类可分为
均匀生物样品： 血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、 乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等体液 呼出气体
非均匀生物样品： 心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫或睾丸、 脂肪、肌肉、皮肤等器官、组织 粪便排泄物
检测组分
即生物样品中的药物及其代谢物等
（1）原形药物的测定； （2）游离药物的监测； （3）活性代谢产物的监测； （4）药物对映体的监测； （5）作用部位药物浓度的测定； （6）体内内源性物质的测定。
生物样品来源
临床前 吸收试验 组织分布试验 代谢 排泄 毒代动力学
临床 临床药代动力学 制剂生物利用度及生物等效性
生物样品种类
生物样品种类选取的一般原则：
（1）必须是能够反映出浓度与药物效应 之间关系；
（2）易于获得； （3）便于处理，适合于分析； （4）根据不同目的与要求进行选取。
生物样品种类
二、生物样品预处理方法
• 应用中注意问题：
• 去蛋白后的上清直接进样对色谱分离及色谱柱和仪 器的影响 ❖ 色谱峰形 ❖ 液质联用分析中的基质效应
• 检测灵敏度是否足够
二、生物样品预处理方法
• 液液萃取
• 操作：
• 血浆＋一定体积萃取溶剂→振荡/涡旋萃取3～ 5min→3500rpm离心10min→取上清液氮气下吹干→流动相 复溶后进样分析
二、生物样品预处理方法
• 常用的生物样品预处理方法 • 沉淀蛋白 • 液液萃取 • 液固提取
二、生物样品预处理方法
• 沉淀蛋白
• 操作：
50μl血浆＋150 μl甲醇→涡旋1min→3500rpm离心10min→取 上清液进样分析
• 常用沉淀剂： • 与水能混溶的有机溶剂——甲醇、乙腈 • 酸性沉淀剂——三氯醋酸、高氯酸
预处理方法
• 分离 • 纯化 • 浓集
实验结果 测定
• 动物实验 • 方法学考察和验证
• 样品前处理 • 样品分析 • 数据处理
具体考虑生物体内药物分析的研究对象即生 物体内样品，则需要从生物样品来源、样品种 类和检测组分三方面来讨论。
1. 生物样品来源：决定于研究的目的 人体与动物
2. 生物样品种类：如体液、器官、组织和排泄物等 3. 检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等
• 选择性高 • 便于纯化和富集 • 操作方便 • 对仪器的污染小
• 缺点：
• 易产生乳化 • 操作费时，不易于自动化
二、生物样品预处理方法
• 液固提取
• 固相萃取
• 超声提取——对于固体生物样品，如粪便，组织等， 匀浆处理后，用合适的有机溶剂进行液固萃取，涡 旋振荡提取或者超声提取，上清液吹干或者进行第 二次液液萃取，以便进一步的纯化富集