最新生物化学 第2章 蛋白质(2)演示教学
活性染色：
根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应 产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色 的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂的蛋 白质样品中检测到目标蛋白出现的位置。活性染色 法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脱氢酶同工酶、 谷氨酰胺合成酶同工酶等)的检测中非常有用。
免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹 (Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分 有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体专 一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在,可以 先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上,然后 用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原-抗体反应,最后 可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体 (通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共接的酶 反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地检到的 目标蛋白。
七 蛋白质的沉降作用及超离心分离
沉降速度(ν = dx / dt )与蛋白质分子的大小和密 度有关。
沉降速度法，适用于分离沉降系数不同但密度相近 的蛋白质。
沉降平衡法，适用于沉降系数相近，但密度不同 的蛋白质。
沉降系数：当沉降界面以恒定的速度移动时，单 位离心场里的沉降速度。
用离心法分离细胞亚微结构
600g,3 min.上清
沉淀：细胞核
6000g,8 min.上清
沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体
沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片
40000g.30 min.上 清
100000g.90 min.上清
沉淀：核糖体亚基
细胞液
平衡密度梯度离心：
用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地 下沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质 的密度范围宽于被分离组分的密度。
（一） 氨基酸的组成分析 蛋白质在标准条件下经酸水解后, 进行氨基酸的组成
分析.通过组成分析基本上可推测出部分水解所产生的肽 碎片的数目。
（二）末端分析(确定蛋白质的肽链组成) ：通常测定肽链 的N-末端. 二硝基氟苯(DNFB)法 或丹磺酰氯（DNSCl）法是常用的方法。丹磺酰氯为一种更有效的试剂， 灵敏度比DNFB法高100倍。
丹磺酰氯分析多 肽链的N－末端
苯异硫氰酸 酯（PITC） Edman试 剂
水解多 肽确定 基酸 组成
确定N末端的 氨基酸残基
确定N末端的氨基酸残基 剩下的多肽可以再利用。
（三）拆开链间或链内的二硫键
（1) 还原法：用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫 苏糖醇等还原性试剂使二硫键打开，还原生成-SH。
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 材料的选择； 2 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； 3 蛋白质初步提纯； 4 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； 5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质 的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白 酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特 定的折叠结构受到破坏。
（2)氧化法：常用过甲酸(CHOOOH)作为氧化剂， 使二硫键氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸残基) 。
（四）肽链的部分水解 常用胰蛋白酶法, 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是
一个典型的多肽，用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶)和溴化氰 分别处理所得到的结果：
差异（速）离心：用不同的离心速度、依据被
分离物的大小而将细胞亚结构彼此分离的效果。
速度区带离心：将样品铺在稀的蔗糖溶液的顶
层，溶液不用于分离而用以抗对流作用，离心完成 后，细胞各成分以其大小不同而在离心管中呈区带 分布，若离心时间太长，或离心力过大，细胞各成 分都会沉降至管底，而达不到分离效果。
差异（速）离心法
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据考 马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的分 离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋白质 的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对该蛋 白质进行定量分析。
三级结构（tertiary structure）：多肽 链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，即整 个肽链（亚基）的空间形状。三级结构指的 是处于充分折叠、具有生物学活性的一个完 整的球蛋白的三维结构， 。
四级结构（quaternary structure）：寡 聚蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间位 置。
二 蛋白质一级结构测定
蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质样 品。
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
生物化学 第2章 蛋白质(2)
（四） 毛细管电泳
毛细管电泳技术是将养品点在装有凝胶的、 直径为20-75 μm 内经的毛细管里，进行电泳。 优点是分辨率高、、样品需要量小。电泳速度 快、上样和分离物的检测都能够进行自动化操 作。因为毛细管散热性能好，允许使用很高的 电压进行电泳。
除分离检测蛋白质外，在核酸的序列分析中 使用较为普遍。
差异（速）离心与平衡密度梯度离心法
第五节 蛋白质的一级结构和测定
（一）蛋白质一级结构概述
蛋白质的结构层次：
一级结构(primary structure)：多肽链内氨基酸残基从N端到 C端的排列顺序，或称氨基酸序列。
二级结构（secondary structure）：多肽链主链不同肽段沿主 轴盘旋折叠而形成的空间结构。二级结构是蛋白质结构的构象单 元。主要有α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲。
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《蛋白质的化学二》PPT课件
几条多肽链通过 二硫键交联在一起。 可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在 下，用过量的-巯 基乙醇(还原法)处 理，使二硫键还原 为巯基，然后用烷 基化试剂 （ICH2COOH）保护 生成的巯基，以防 止它重新被氧化。
胰岛素 -巯基乙醇
碘乙酸
3、分析每一条多肽链的氨基酸组成
经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解， 测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子 比或各种残基的数目。
COOH
CH2SH
H2N CH CH2 CH2 CO HN CH CO HN CH2 COOH αβγ
γ-谷氨酰
半胱氨酰
还原性 谷胱甘肽
甘氨酸
谷胱甘肽的生理功能十分广泛，其主要功能有：
(1)清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉 毒素等毒物；
(2)参与氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的转运；
4）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基； 5）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N 指向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。一般习 惯把氨基写在左端，羧基写在右端;注意氨基酸残基顺序 的差别：如：甘-丙；丙-甘。
R1 O R2 H2N CH C N CH COOH
H
C
肽键的酰胺氮和羰基氧之间发生共振相互 作用产生几个重要结果:
(8)谷胱甘肽在免疫系统抗感染和炎症反应中发 挥着重要作用，它对于淋巴 细胞增殖及正常功能的发挥起着重要的作用；
(9)参与胰岛素的代 谢，一降低雌激素、前列腺素、白细胞三烯的活性；
(10)作为抗癌、抗肿瘤及治疗艾滋病的辅助药物。
2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨 酸），可促进甲状腺素的释放。
S
S
胰岛素 -巯基乙醇
碘乙酸
3、分析每一条多肽链的氨基酸组成
经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解， 测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子 比或各种残基的数目。
COOH
CH2SH
H2N CH CH2 CH2 CO HN CH CO HN CH2 COOH αβγ
γ-谷氨酰
半胱氨酰
还原性 谷胱甘肽
甘氨酸
谷胱甘肽的生理功能十分广泛，其主要功能有：
(1)清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉 毒素等毒物；
(2)参与氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的转运；
4）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基； 5）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N 指向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。一般习 惯把氨基写在左端，羧基写在右端;注意氨基酸残基顺序 的差别：如：甘-丙；丙-甘。
R1 O R2 H2N CH C N CH COOH
H
C
肽键的酰胺氮和羰基氧之间发生共振相互 作用产生几个重要结果:
(8)谷胱甘肽在免疫系统抗感染和炎症反应中发 挥着重要作用，它对于淋巴 细胞增殖及正常功能的发挥起着重要的作用；
(9)参与胰岛素的代 谢，一降低雌激素、前列腺素、白细胞三烯的活性；
(10)作为抗癌、抗肿瘤及治疗艾滋病的辅助药物。
2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨 酸），可促进甲状腺素的释放。
S
S
生物化学蛋白质化学ppt课件
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9
3）防御功能：抗体、溶菌酶、（肠道等分泌的）粘 蛋白等
4）信息传递功能：起接受和传递信息作用的受体蛋 白等
5）调节和调控功能：激素、调节因子
3、储存和营养功能
蛋中的卵清蛋白、乳中的酪蛋白、小麦种子中的麦 醇溶蛋白等
4、氧化供能
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10
第二节 氨基酸的结构、分类和性质
N-Formylmethionine (fMet) is a proteinogenic amino
acid. It is a derivative of the amino acid methionine in
which a formyl group has been added to the amino
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27
极性中性R基团
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28
极性中性R基团
丝氨酸，Serine，Ser（S） 羟甲基
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29
极性中性R基团
苏氨酸， Threonine， Thr（T）， 有两个手性碳原子
EAA
It is susceptible to numerous posttranslational modifications
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21
异亮氨酸，Isoleucine,Ile（I） 有两个手性碳原子
branched-chain amino acid essential amino acid
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22
蛋氨酸（甲硫氨酸），Methionine ,Met （M） 侧链含甲硫基（甲基硫醚基 )
essential amino acid
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5
生物化学2(共73张PPT)
氨基酸缩写符号：略
氨基酸的理化性质
①PI，两性解离 概念： ②紫外吸收：280nm（色、苯、酪） ③颜色反应、“茚三酮”570nm
3. 掌握肽键、多肽链一级结构和高级结构的概念
[肽]
概念：2个aa之间
→以酰胺缩合，此酰胺键称为
肽键。-CONHC-
肽链：有方向性自N→C，链内的aa叫残基。
生物活性肽：10肽以内为寡肽，MW. 1万以内为多
蛋白质变性是由于 A. 蛋白质的一级结构的改变 B 蛋白质亚基的解聚 C 蛋白质空间构象的破坏
D 辅基的脱落 E 蛋白质水解
答案：[C]
[评析]： 本题考点：蛋白质变性的概念
在某些理、化因素作用下，使蛋白质特定的空间构象破坏，导致 其理化性质 改变、生物学性质改变，称为蛋白质的变性作用。一般认为蛋白质变性主要发生二 硫键和非共价键破坏，即空间构象的破坏并不涉及一级结构的改变。
酶
[概念]：
缺O 时，葡萄糖分解生成乳酸的过程。 主要: 肝 70 ~ 80 %
2 [调节]：四个关键酶。
FFA ATP CoA 脂酰CoA +AMP + PPi
[部位]：胞液。 特点：Km不变， Vmax↓
核酸的一级结构、空间结构与功能。
白三烯：过敏反应的慢反应物质，促进炎症和过敏反应等
抗代谢物的作用及机制。
米式常数的意义
①Km为速度是最大反应速度一半时的[S] ②[S]≥Km, Km不计, V=Vmax ③[S]≤Km,分母的[S]不计,反应速度V与[S]成正比
④Km反映酶与作用物的亲合力,Km大，亲合力小； Km小，亲合力大。
（2）酶浓度的影响：V与酶浓度成正比。 （3）pH的影响：最适pH——酶活性最大时的pH。
氨基酸的理化性质
①PI，两性解离 概念： ②紫外吸收：280nm（色、苯、酪） ③颜色反应、“茚三酮”570nm
3. 掌握肽键、多肽链一级结构和高级结构的概念
[肽]
概念：2个aa之间
→以酰胺缩合，此酰胺键称为
肽键。-CONHC-
肽链：有方向性自N→C，链内的aa叫残基。
生物活性肽：10肽以内为寡肽，MW. 1万以内为多
蛋白质变性是由于 A. 蛋白质的一级结构的改变 B 蛋白质亚基的解聚 C 蛋白质空间构象的破坏
D 辅基的脱落 E 蛋白质水解
答案：[C]
[评析]： 本题考点：蛋白质变性的概念
在某些理、化因素作用下，使蛋白质特定的空间构象破坏，导致 其理化性质 改变、生物学性质改变，称为蛋白质的变性作用。一般认为蛋白质变性主要发生二 硫键和非共价键破坏，即空间构象的破坏并不涉及一级结构的改变。
酶
[概念]：
缺O 时，葡萄糖分解生成乳酸的过程。 主要: 肝 70 ~ 80 %
2 [调节]：四个关键酶。
FFA ATP CoA 脂酰CoA +AMP + PPi
[部位]：胞液。 特点：Km不变， Vmax↓
核酸的一级结构、空间结构与功能。
白三烯：过敏反应的慢反应物质，促进炎症和过敏反应等
抗代谢物的作用及机制。
米式常数的意义
①Km为速度是最大反应速度一半时的[S] ②[S]≥Km, Km不计, V=Vmax ③[S]≤Km,分母的[S]不计,反应速度V与[S]成正比
④Km反映酶与作用物的亲合力,Km大，亲合力小； Km小，亲合力大。
（2）酶浓度的影响：V与酶浓度成正比。 （3）pH的影响：最适pH——酶活性最大时的pH。
生物化学 第2章 蛋白质(2)
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 3 材料的选择； 蛋白质初步提纯；
2 组织匀浆的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；
5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白 质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋 白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质 特定的折叠结构受到破坏。
600g,3 min.上清 沉淀：细胞核 6000g,8 min.上清 沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体 沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片 沉淀：核糖体亚基
40000g.30 min.上清 100000g.90 min.上清
细胞液
平衡密度梯度离心： 用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地下 沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质的 密度范围宽于被分离组分的密度。
二 蛋白质一级结构测定 蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质 样品。 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据 考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的 分离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋 白质的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对 该蛋白质进行定量分析。
生化2蛋白质化学
如：100克胰岛素 分析得到 phe8.6克，其重量百分数为：
氨基酸含量
*
残基分子量 氨基酸分子量
= 8.6*
147 165
= 7.7克
2.根据百分组成计算氨基酸的分子个数
如：胰岛素分子量为6000，丙氨酸占4.6%，氨基酸个数为：
氨基酸的百分含量*蛋白质分子量 氨基酸的分子量
=
4.6%*6000 89
CH NH 3 KCOOH
CH 2 4
H+
NH 3
COO
COO
CH NH 3 Kα-NH 3 CH NH 2
CH 2 4
H+ CH 2 4
NH 3
NH 3
K ε-NH 3 H+
COO CH NH 2 CH 2 4 NH 2
ε-NH 3
（++）
（+）
（± ）
（- ）
Asp解离如下:
COOH
CH NH 3 CH 2 COOH
浓硫酸+浓硝酸 苯基、酚基
硝酸汞（亚汞） 酚基
颜色 黄色 红色
乙醛酸反应 坂口反应 福林酚反应
乙醛酸 萘酚+NaClO 磷钼酸+磷钨酸
吲哚基
紫红
胍基
红色
酚基、吲哚基 蓝色
Pauly反应 巯基反应
重氮盐
亚硝酸亚铁氰 酸钠
咪唑基 酚基 巯基
棕红色 桔黄色 红色
用途 Phe Tyr
Tyr
Trp Arg Trp Tyr
氨基酸酰肼
C-端氨基酸
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热， C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化 物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。