霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
药品的微生物限度检查
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(15版中国药典公示稿)
胰酪大豆胨 琼脂培养基 和胰酪大豆 胨液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时间不超过 3 天，接种 量不大于 100cfu
胰酪大豆胨 琼脂培养基 / 胰酪大豆 胨液体培养 基 （ MPN 法），培养 温 度 30 ～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 3 天，接种量 不大于 100cfu
计数培养基适用性检查 计数方法适用性试验
试验菌株
试验菌液 的制备
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus) 〔CMCC(B)26 003)〕
胰酪大豆 胨琼脂培 养基或胰 酪大豆胨 液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时 间 18 ～ 24 小时
获得丰富
的孢子
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，
检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学
特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。
胰酪大豆胨 琼脂培养基 （ MPN 法 不 适用），培 养温度 30～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 5 天，接种量 不大于 100cfu
沙氏葡萄 糖琼脂培 养基，培养 温度 20～ 25℃，培养 时间不超 过 5 天，接 种量不大 于 100cfu
沙氏葡萄 胰酪大豆胨 沙 氏 葡 萄 胰酪大豆胨 沙氏葡萄
糖琼脂培 琼 脂 培 养 糖 琼 脂 培 琼脂培养基 糖琼脂培
黑曲霉
养基或马 基，培养温 养基，培养 （ MPN 法 不 养基，培养
《中国药典》2015年版微生物计数法实例
SDA
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （薄膜过滤法）
试验组
（样+菌）
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液，供试 液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液，使试管中含菌量不大于 100cfu/mL，吸取1mL进行薄膜过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗， 100mL/次，滤膜贴在相应的培养基上。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的 供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
/
/
T/S
0.92
0.91
0.92
1.07
1.08
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应 在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：霉菌和酵母菌总数计数培养基适用性检查结果（SDA）
菌种
被检培养基菌落数 （T）
中国药典2015版 四部 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则110 7），特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu，那么最高稀释级是1：10 3 。
15版药典与10版药典微生物区别
15版药典与10版药典微生物区别一、微生物计数法1、计数方法（1）平皿法（15版包含平皿法、涂布法）（2）薄膜过滤法（3）MPN法（最可能数法）新增2、计数培养基适用性检查（1）菌种及菌液的制备15版药典新增PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液可以作为稀释液，0.9℅无菌氯化钠同样可以使用。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌增菌由营养肉汤培养基或营养琼脂培养基改为胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基。
白色念珠菌增菌由改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基改为沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度由23～28℃改为20～25℃。
黑曲霉增菌由改良马丁琼脂斜面培养基改为沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度由23～28℃改为20～25℃。
(2)培养基适用性检查10年药典判断依据：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70℅，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
15年药典判断依据：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
3、供试品计数方法适用性试验（1）供试液的制备10年药典制备方法特点：稀释液为PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分类：液体供试品，固体、半固体或黏稠性供试品，需用特殊方法制备供试液的供试品（非水溶性供试品、膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂喷雾剂供试品、贴膏剂供试品、具抑菌活性的供试品）。
15年药典制备方法特点：稀释液为PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，或PH7.25磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基分类：水溶性供试品，水不溶性非油脂类供试品，油脂类供试品，需用特殊方法制备供试液的供试品（膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂喷雾剂供试品、贴膏剂供试品）（2）抗菌活性的去除或灭活15年药典方法比10年药典少了离心沉淀法4、供试品检查（1）检验量10年药典：一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。
2015版中国药典检验操作规程
1.1无菌操作要求
? 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包 装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。
? 1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和 针与杆的连接处。
有毒有菌污物处理要求143涂片染色冲洗片的液体一般可直接冲入下水道强致病菌的冲洗液必须冲在烧杯中经高压灭菌后方可倒入下水道染色的玱片放入5煤酚皂溶液中浸泡24144打碎的培养物立即用5煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位浸泡半小时后再擦拭干净
2015年版药典
? 微生物检验规程
1.1无菌操作要求
? 1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
1.2无菌间使用要求
? 1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放 与实验无关的物品。
? 1.2.2 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于 30min ，使用紫 外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精 棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
? 大肠埃希氏菌 胰酪大豆胨液体培养基
? 沙门菌
胰酪大豆胨液体培养基
2.7.3选择和分离培养
? 2.7.3.1 耐胆盐革兰阴性菌：取相当于 0.1g、0.01g 和0.001g( 或0.1ml 、0.01ml 和 0.001tnl) 供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积 (经方法适用性试验 确定）肠道菌增菌液体培养基中， 30? 3 5℃培养 24? 4 8小时。
中国药典2015版-微生物限度检查解析
菌种的传代、保藏与管理
控制程序
菌种来源
菌种的保 管
菌种的复 活
菌种确认
菌种的储 存和领用
菌种的销 毁及领用 记录
菌种传代、保存、使用及销售记录
菌种名称： 传 代 日 期 菌 种 来 源 菌种编号： 传 代 支 数 菌 种 生 长 培 养 基 培 养 温 度 时 间 保 存 温 度 保管人： 发 出 日 期 发 出 方 式 日期： 购 买 单 位
《中国药典》2015年版-微生物限度 标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合 并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物 限度标准。
标准修订内容
参考欧美日药典标准 <1>修订菌数标准表达方式： 指数形式10ncfu，最大可接受限度值遵守2倍规则： 101cfu： 可接受的最大菌数为 20； 102cfu： 可接受的最大菌数为 200； 103cfu： 可接受的最大菌数为 2000：依此类推。 <2>检查指标： 需氧菌总数：TAMC（替代细菌数）----胰酪大豆胨琼脂培养基 耐胆盐的格兰阴性菌（替代大肠菌群） <3>检查制剂分类： 齿龈、皮肤制剂 原辅料、中药提取物、中药饮片的控制 呼吸道制剂耐胆盐格兰阴性菌的控制
增加新概念
• • • • • 1.MPN法使用范围：含菌量较低的供试品细菌总数测定 2.“分散均匀”：并非一定要溶解 3.偏差调查概念引入 当检验结果出现超常或超标时需要进行偏差调查 调查范围：人、机、料、法、环
控制菌检查法修订解析
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法---新增内 容
2015版药典微生物菌数报告规则
培训老师：何笛
目录
1、《2015版药典》菌数报告规则 2、《食品微生物学检验 菌落总数测定》菌数报告规则
3、菌落计数及报告方法实例：
1、《2015版药典》菌数报告规则
平皿法：
培养和计数：在30～35℃培养3～5 天，沙氏葡萄糖琼脂培 养基平板在20～25℃培养5～7 天，观察菌落生长情 况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。 菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后， 计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规 则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值 不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以 上。
报告方式
38000或 3.8×104
2、若有两个稀释度，其平均菌落数均在0～300个
之间，则取最髙的平均菌落数(见表中例2及例3)
例 子 2 最髙 的平 1/10 1/100 1/1000 均菌 落数 1365 164 20 164 不同稀释度的 平均菌落数 菌落 总数 16400 报告方式 16000或 1.6×104 27000或 2.7×104
4
513000
4、如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀
释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时， 以< 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 (见表中例 7)
例 子 不同稀释度的 最低 菌落 平均菌落数 稀释 报告方式 1/10 1/100 1/1000 倍数 总数 ＜1或0 0 0 ＜1 ＜10 ＜1×10
7
5、菌落计数的报告
5.1、菌落数小于100cfu时，按“四舍五入”原则修约，
以整数报告。 5.2、菌落数大于或等于100cfu时，第3位数字采用“四 舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数； 也可以用10的指数形式来表示，按“四舍五入”修约后， 采用两位有效数字。 5.3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌 落蔓延。 5.4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 5.5、称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/ml为 单位报告。
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霉菌与酵母菌计数方法
1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)
白色念珠菌(0)代
↓
传代培养
↓
实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养
基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天
↓
计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,
培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu
↓
计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温
度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基
1.１菌种
试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)
取白色念珠菌得新鲜培养物
↓
用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液
取黑曲霉得新鲜培养物
↓
加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无
菌氯化钠溶液,将孢子洗脱
↓
采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内
↓
用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯
化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液
菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、
1。
３阴性对照
为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、
2、培养基适用性检查
按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板
↓
置表１规定条件下培养
↓
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿
↓
同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验
↓
被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
5-2范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管比较,试验
菌应生长良好
3计数方法适用性试验
供试液制备:水不溶性非油脂类供试品
↓
取供试品,用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液,或pH7。
2磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨
液体培养基
↓
制备成１:10供试液。
↓
若需要,调节供试液ｐH值至6~8。
必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释、
⒉接种与稀释
所加菌液得体积应不超过供试液体积得1％、为确认供试品中得微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。
供试液接种后,按下列“微生物回收"规定得方法进行微生物计数。
若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值小于菌液对照组菌数值得50％,可采用下述方法消除供试品得抑菌活性、
⑴加稀释液或培养基体积、
⑵入适宜得中与剂或灭活剂
⑶采用薄膜过滤法。
5供试品中微生物得回收
表1所列得计数方法适用性试验用得各试验菌应逐一进行微生物回收试验、微生物得回收可采用平皿法、薄膜过滤法或ＭPN法。
(预方法就是平皿法)平皿法包括倾注法与涂布法。
表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿,以算术均值作为计数结果。
(１)倾注法
取照上述“供试液得制备”、“接种与稀释”与“抑菌活性得去除或灭
活"制备得供试液1ｍl
↓
置直径90mm得无菌平皿中
↓
注入1５～20mｌ温度不超过
４5℃熔化得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基
↓
混匀,凝固,倒置培养、(若使用直径较大得平皿,培养基得用量应相应增加)
↓
按表1规定条件培养、计数
↓
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组得平均菌落数。
(2)涂布法
取15～20ｍl温度不超过45℃得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂
培养基↓
注入直径9０ｍm得无菌平皿,凝固,制成平板
↓
采用适宜得方法使培养基表面干燥(若使用直径较大得平皿,培养基用量也应相
应增加)↓
每一平板表面接种上述照“供试液得制备”、“接种与稀释"与“抑菌活性得去除或
灭活”制备得供试液不少于０。
１ml
↓
按表1规定条件培养、计数
↓
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组得平均菌落数
6、结果判断
计数方法适用性试验中,采用平皿法或薄膜过滤法时,试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值与菌液对照组菌落数得比值应在0.5~2范围内验均符合要求,照所用得供试液制备方法及计数方法进行该供试品得需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数计数。
7、供试品检查
(１)除另有规定外,一般供试品得检验量为10g或10ml;
(２)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数;沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌与酵母菌总数。
(3)培养与计数除另有规定外,胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~３5℃培养３～5天,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5～7天,、
(4)菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于3００cfｕ得稀释级、霉菌与酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于1０0cｆu得稀释级。