双酶切及连接
双酶切及连接
限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是 否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大 类。
限制性内切酶的类型
第一类（I型）限制性内切酶：能识别专一 的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地 方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺 序没有专一性，是随机的。这类限制性内 切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不 大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 这类酶如EcoB、EcoK等。
dna完全没有被内切酶切割原因对策内切酶活性下降内切酶稀释不正确dna不纯反应条件不佳内切酶识别的dna位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰部分dna溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大取样不准酶切后dna粘末端退火由于反应溶液温度强烈振荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序用510倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上反应前离心数秒将内切酶稀释增大取样体积电泳前将样品置65保温510分钟取出后置冰浴骤冷使用标准反应缓冲液及温度避免强烈振荡适当稀释酶液反应液稀释的酶不能贮藏使用最佳反应体系加大酶量510倍问题二
限制性内切酶的类型
第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的
识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固 定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是 特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。 因此也不能应用于基因克隆。
限制性内切酶的类型
第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性 内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。
双酶切连接反应之全攻略(
双酶切连接反应之全攻略(双酶切连接（Double Digestion）是一种常用的分子生物学技术，用于在DNA分子上选择性地切割两个特定的限制性内切酶位点。
它可以用于构建重组DNA，进行基因克隆，等等。
下面是一个全面的双酶切连接反应的攻略，包括实验前的准备工作，实验步骤和注意事项。
实验前的准备工作：1.获得限制性内切酶：选择两个互不相容的限制性内切酶。
确保这两个酶能够在相同的反应缓冲液中活性工作。
2.准备DNA底物：获得需要连接的DNA片段。
可以通过PCR扩增，限制性消化或DNA合成等方法获得。
3.选择连接载体：选择合适的连接载体，如质粒。
确保载体具有想要插入的目标基因的适当特性，如选择性标记物（如抗生素抗性基因）和启动子等。
4.验证限制酶位点：使用限制性内切酶图谱检测DNA片段和连接载体中的限制酶位点。
这有助于确定两个限制酶是否能够溶解目标DNA片段。
实验步骤：1.提取DNA：从细菌培养基中提取所需的DNA片段。
可以使用商用试剂盒或自制提取方法。
2.酶切反应：在适当的反应条件下，将需要连接的DNA片段和连接载体分别与两个限制性内切酶一起孵育。
反应条件包括酶的浓度，缓冲液的类型和pH值，反应温度和孵育时间。
3.酶停止反应：通过加入酶停止缓冲液或加热短暂孵育，停止酶切反应。
这样可以避免过度消化和限制酶反应继续进行。
4.凝胶电泳：将切割后的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分析。
这一步骤可以检测酶切效率和特异性。
将反应样品和相应的对照样品（未经酶切）加载到琼脂糖凝胶上，然后运行电泳以分离DNA片段。
5.库仑凝胶纯化：根据所选的DNA片段大小，可以选择不同浓度的琼脂糖凝胶切片进行纯化。
将所需大小的DNA片段切割下来并进行库仑凝胶分离。
6.连接反应：将纯化的DNA片段与连接载体进行连接反应。
可以使用商业化的连接试剂盒，其中包含待连接DNA和连接载体之间的连接酶，以及其他必要的试剂。
7.转化：将连接后的DNA样品转化到合适的宿主细胞中。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点1.选择适当的酶切位点：在进行双酶切连接反应之前，需要选择适当的酶切位点。
这些酶切位点应该满足以下几个要求：-位点不应该在目标DNA序列中出现，以避免酶切产生剪切产物；-两种酶切位点应该在目标DNA序列中相对靠近，以确保连接的有效性；-酶切位点的序列应该被两种酶同时识别和切割。
2.协议的优化：双酶切连接反应的协议需要进行优化，以确定最适合的条件。
一些重要的实验条件包括反应缓冲液的成分和浓度、酶的浓度和反应温度。
对于每个反应参数，应该进行范围的优化实验，以确定最佳的条件。
3.应用正确的酶切酶：双酶切连接反应需要同时使用两种酶来进行切割。
这些酶应该是互相兼容的，并且能够在相同的反应缓冲液中活性。
此外，酶的纯度和活性也应该得到保证，以确保酶切的效果。
4.反应的时间和温度：双酶切连接反应的时间和温度都需要进行优化。
反应时间应该足够长，以确保两种酶都能充分切割目标DNA序列，并且不会出现过度切割的情况。
反应温度也应该适中，通常在酶的推荐温度范围内选择。
5.质量控制：在完成双酶切连接反应之后，应该进行质量控制以确保反应的成功。
常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。
通过这些方法，可以检测连接产物的大小和纯度，并确认连接的正确性。
6.反应产物的处理：根据实验需要，对双酶切连接反应的产物进行处理。
这可能包括：-凝胶电泳分离：使用琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的连接产物；-提取纯化：通过凝胶电泳或商业化学试剂盒，从琼脂糖凝胶中提取并纯化连接产物；-DNA测序：对连接产物进行测序，以确认连接的正确性。
总之，双酶切连接反应是一种常用的分子生物学技术，但在实验中需要注意一系列要点。
选择适当的酶切位点、优化实验条件、正确选择酶切酶、时间和温度的控制，以及进行质量控制和反应产物的处理，对于确保双酶切连接反应的成功至关重要。
这些注意要点的遵守可以确保实验结果的准确性和可靠性。
连接双酶切
连接双酶切连接双酶切PCR鉴定目的片段是否连接上表达载体可能的原因，1.表达载体双切不充分，载体量太大，而酶又加的太少，酶切时间短2.连接最好是12～16小时，因为你的目的片段和载体的浓度比，不是很合适3.回收胶的问题今天酶切时没有和空载体对比，TE，含有EDTA，会抑制连接酶的活性洗下来后要先确定一下浓度，浓度太低可定连不上1：在使用 Wash Buffer 洗涤前，在柱子中加入少量 (200ul) 溶胶液。
室温3-5 分钟后，离心。
再接标准洗涤及以后操作。
该操作针对胶块大的情况。
2：加入 Wash Buffer 后，静置 1-3 分钟后，再离心。
3：增加 Wash Buffer 的洗涤次数 (少量多次)。
胶的残留导致的问题不是单纯的胶残留问题，同时也会导致溶胶液中盐的残留 - 这似乎对连接影响更大。
最好的解决方法是 1；当然，可能会导致得率的小量下降，但质量绝对好。
为了充分去除残留，总结，1.多加一步200ul溶胶液，2.加 Wash Buffer 前空柱离心 30 sec，3.Wash Buffer洗涤时静置及多次柱子允许胶通过的量是有限的，胶越多或是浓度太大，残留就会更明显，所以切胶时应该尽量要小，假如过大的话分到两个柱子里应该比较好，另外就是溶胶液宁可多加也不能少加首先要保证待测质粒的纯度,除PCR外,可以对重组质粒做两个双酶切反应：1.ECoR I与Xh0 I双酶切; 2.选一个插入片段中特异存在的切点酶和质粒ECoRI下游到Xba1间的合适位点酶(插入片段中没有的),进行双切,结果可以预测到.每个双切反应包括酶1单切,酶2单切,双切三个反应,别忘了以空载体做对照.试试看.如果没有得到重组质粒只好再连接反应了.酶是TAKARA的,方法就是按说明书上做的,酶各1微升,buffer 2微升,质粒5微升,20微升体系.遇到双酶切可是两个酶没有共用buffer时两种办法：一是低盐buffer的酶先切，然后乙醇沉淀回收，然后高盐buffer的酶再切，乙醇沉淀或切胶回收。
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为××=µg。
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
双酶切连接
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
2.纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒3.酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
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思考题
影响限制性内切酶活性 的因素有哪些？
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值
• 为什么任何时候2种酶 的总量不能超过反应 体系的1/10体积？
• 我们平时所用的酶试剂中 都含有一定量的甘油，用 量过多容易使酶产生星号 活性，即限制性酶的特异 性会受影响。
BgⅢ SaⅡ 10× Buffer 质粒 无菌水 总体积
0.6μL 0.6μL 2μL 16μL 0.8 μL 20μL（无菌水补至 总积）
反应条件：温度37℃，酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条 带，质粒无条带。 • 分析：质粒无条带， 可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带， 可能是酶切后DNA片 段太小，导致结果模 糊。
反应体系
10× Buffer 载体 2.5μL 2μL 2μL 1μL 18.5μL
DNA T 4酶 无菌水
注意事项
• 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 • 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查 阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活 力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似 的话可以考虑各取一半中和。 • 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同 则必须分别做酶切 • 特别注意：在双酶切载体时如果2个酶切位点*得很近，必 须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列 的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有 的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则 就可能造成酶切失败。
本组
连接
• DNA 分子的体外连接（重组）是指外源 DNA 片段和载体 DNA 分子在体外通过 DNA 连接酶共价连接。 • 选用一种对载体 DNA 只具唯一限制点的限 制酶，进行位点特异的切割，形成全长的 具粘性末端的线性 DNA 分子。再将外源 DNA 大片段也用同种限制酶切割，产生同 样的粘性末端。最后用 T 4 噬菌体 DNA 连 接酶能很容易地将载体与外源目的基因连 接起来。
双酶切及连接
指导老师：陈思 制作人：王鹏飞 组别：2组
Hale Waihona Puke 目录• • • • • • • 实验原理 仪器、材料与试剂 实验过程 结果及分析 连接 注意事项 思考题
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶 具有专一性，一种酶只能识别一种特定的 脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种 酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向 切割的目的。
仪器、材料与试剂
• • • • • • • • • • 水浴锅 移液枪和枪头 制冰机 浮板 PCR产物 SaⅡ酶 BgⅢ酶 10×H Buffer 无菌水 小离心管
实验过程
• 质粒DNA的双酶切 反应体系：
BgⅢ SaⅡ 10× Buffer PCR产物 无菌水 总体积
0.6μL 0.6μL 2μL 10μL 0.8 μL 20μL（无菌水补至 总积）