酶切与连接
质粒的酶切、连接、与转化
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转载▼质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。
质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。
T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。
当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。
（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
实验酶切与连接
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原因
1. 内切酶失活
2. DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等 内切酶抑制因子
3. 条件不适（试剂、温度）
4. DNA酶切位点上的碱基被甲基化
对
5. DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn 策
I）
6. DNA位点上存在其它修饰
7. DNA不存在该酶识别顺序
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用 而“粘合”。
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别 位置是：
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用 而“粘合”。
一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原 核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ侵袭。
EcoRI PrimerGST6p1-APOA1-down: 5’ CGCGTCGACTCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3’
SalI
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。
《双酶切及连接》课件
• 双酶切技术简介 • 双酶切的实验步骤 • 双酶切的应用 • 双酶切的注意事项 • 双酶切技术的发展趋势
01
双酶切技术简介
酶切技术的定义
01
02
03
酶切技术定义
酶切技术是一种利用酶的 专一性对特定底物进行切 割的生物技术。
酶的专一性
酶只对特定的底物起作用 ，切割位点具有高度专一 性。
双酶切技术的改进与创新
新型限制性核酸内切酶的 开发
随着生物技术的不断发展，新型限制性核酸 内切酶不断涌现，为双酶切技术提供更多选 择和灵活性。
自动化双酶切系统的研发
通过自动化技术实现双酶切的快速、高效和 标准化操作，提高实验效率并减少人为误差
。
双酶切技术的发展前景
01
双酶切技术在基因克隆和基因治 疗等领域的应用前景广阔，未来 将继续发挥重要作用。
05
双酶切技术的发展趋势
双酶切与其他技术的结合
双酶切与PCR技术的结合
通过双酶切技术将目的基因和载体进行酶切，再利用PCR技术进行扩增和鉴定，提高基 因克隆的效率和准确性。
双酶切与基因编辑技术的结合
将双酶切技术与CRISPR-Cas9等基因编辑技术结合，实现对特定基因的敲除、敲入和 定点突变等操作，为基因功能研究和基因治疗提供有力工具。
02
随着生物技术的不断进步，双酶 切技术将与其他技术不断融合创 新，为生命科学研究提供更多有 力工具。
THANKS
感谢观看
酶切技术的分类
单酶切技术
使用一种限制性内切核酸酶对 DNA进行切割。
双酶切技术
使用两种不同的限制性内切核酸酶 对DNA进行切割，通常用于产生 具有不同黏性末端的DNA片段， 便于后续的连接反应。
酶切连接法
酶切连接法
酶切连接法是一种分子生物学技术，用于将不同的 DNA 片段连接在一起。
该方法通常包括以下步骤：
1. 酶切：使用特定的限制酶将待连接的 DNA 片段进行切割，产生特定的粘性末端。
2. 纯化：通过凝胶电泳或其他方法，将切割后的 DNA 片段进行纯化，去除杂质和未切割的 DNA。
3. 连接：将纯化后的 DNA 片段与载体 DNA（如质粒或病毒载体）在连接酶的作用下进行连接。
连接酶能够将粘性末端连接在一起，形成新的 DNA 分子。
4. 转化：将连接后的 DNA 分子导入宿主细胞中，如大肠杆菌或酵母细胞。
转化可以通过热激法、电穿孔法或化学转化法等方法进行。
5. 筛选：通过选择性培养基或其他方法，筛选出含有连接后的 DNA 分子的宿主细胞。
6. 鉴定：对筛选出的宿主细胞进行鉴定，确认其中含有连接后的 DNA 分子。
酶切连接法是一种常用的 DNA 克隆技术，可以用于构建基因文库、表达载体、基因敲除等实验。
该方法具有高效、简便、快速等优点，是分子生物学研究中不可或缺的技术之一。
酶切-连接-转化
酶切-连接-转化
酶切-连接-转化
一：酶切
1〕载体：pNZ8148，在-20度冰箱，从上往下第二个格子，在一个橙色的
放1.5ml离心管的板上〔特征：盖上写pnz1，pnz2，pnz3。
pnz18，有的已用，就没有，上面吸附柱，下面1.5ml离心管〕。
此载体
浓度较高，且27号我做的酶切回收，回收产物〔只加溶胶液，未纯化〕
在-20度冰箱，需要DNA回收试剂盒提取。
2〕目的基因：均连在T-5载体上，R基因位置,特征同pNZ8148，上
面写(R1R2R3…),R是已经提好的质粒，但我酶切没切开，你测一下nano
再决定是重新摇还是酶切。
3〕所有保藏的菌种均在-20度冰箱第二格〔一个袋中，袋上写igem
带功能基因菌种保存，其中在这袋中有很多小袋，每个袋里不同的菌〕。
4〕B基因在一1.5ml离心管里，在-20度冰箱第二格有一白色的盒子。
量挺多的，是十管合一起，标号忘了，你看下面能分出来。
5〕酶到处缺〔赵老师有HindIII〔NEB,TARARA〕,尹老师有XbaI 〔NEB〕〕，TAKARA的缓冲液要1*M,NEB的是NEBuffer2，我用的NEB的，Buffer2为体系量除10〔如100u体系加10ul〕6〕酶切3.h以上二：连
接连接酶〔没做过加连接酶的，〕问问李贽或张贺〔要是张贺回去的话〕，加完基因，载体，酶，缓冲液〔不知道加不加〕，还要加olution2或3，忘了三：转化1〕Tran-T1问赵信或一组2〕氯霉素的板，4°冰箱，从上
往下数第一个格。
很多，写着Cm，pNZ8148氯霉素抗性。
实验酶切和连接
DNA DNA克隆的技术路线大致 包括以下几个程序：① 分离制 备待克隆的DNA片段(目的 DNA)。② 选择合适的载体 。 ③在体外连接目的DNA和载体。 ④将重组DNA分子转入宿主细 胞，并筛选和鉴定阳性重组子。 ⑤ 扩增阳性重组子。
实验九 质粒酶切与鉴定
一. 实验目的
1. 了解质粒酶切鉴定原理。 2. 掌握核酸片断回收纯化操作技术 3. 学习核酸片断连接的原理和方法
DNA片段之间的连接 主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核 苷酸裸露的3’羟基和 5’磷酸之间形成共价结合 的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,
需ATP。
连接酶：把基因连在一起
二. 仪器和试剂
1. 仪器： 离心机 ， 水浴锅， 电泳仪
2. 材料：待回收DNA样品
3.试剂：
1) DNA回收试剂盒 2）T4 DNA连接酶 3）10X T4 DNA ligase buffer：Tris-HCl（pH 7.6）； MgCl2；DTT；ATP。
5）取回收试剂盒中吸附柱EC装在2ml收集管上，将上一步所得 溶液加入吸附柱EC中。室温放置1min, 12000rpm离心 1min,弃去收集管中平衡液，将柱子套回；
6）加入700ul 漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心 1min ，弃去废液； 7）加入500ul 漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心 1min，弃去废液；
三. 操作步骤
1. DNA酶切条带回收
（北京艾德莱生物胶回收试剂盒）
1) 用干净无菌的刀片在 365 nm紫外光下切割目的 DNA 条带，放入1.5mL Ep管中，积累凝胶至大约300ul。
2)将目标片段切下的胶转移到预先称重的1.5ml eppendorf 管中，称取凝胶重量。按照0.1g=100ul估算凝胶体积， 3) 加入3倍体积的溶胶液DD。 4) 56℃水浴 10min或直到凝胶完全溶解。每隔2 min摇荡 一次。
实验3酶切与连接
实验3酶切与连接实验三、酶切与连接⼀、实验⽬的与原理简介限制性内切酶在基因⼯程中主要应⽤地以下两个⽅⾯：制作基因酶切图谱和进⾏基因克隆。
制作基因图谱，就是利⽤特定的酶切出特定的条带；⽽利⽤基因克隆时选择酶应注意以下⼏个⽅⾯：1）克隆⽚段的长度；2）克隆⽚段中切点的情况3）载体上切点的情况；4）切割与连接⽅式；5）接头状态。
酶切⽅式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同⼀DNA ⽚段上有些被切开⽽另⼀些未被切开，此法主要应⽤于基因的克隆。
⽤部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。
进⾏部分酶切可通过两个⽅式：⼀是不同的时间内在同⼀酶反应管中取样终⽌反应，利⽤时间来控制酶切的程度。
另⼀种是在其余条件相同时控制酶的稀释度，利⽤不同酶浓度控制酶切程度，这种⽅法因易于控制反应⽽被⼴泛应⽤。
2）完全酶切法适⽤于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA ⽚段的分离⼯作。
完全酶切⼜可分为单酶切、多酶切两种。
在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同的反应条件时，可同时进⾏酶切，不然须在前⼀种酶作⽤完成后将其失活，⽽后进⾏第⼆种酶切反应，这样可以避免⽚段混乱现象的出现。
⼆、材料和试剂限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温⽔浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪三、实验步骤1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下：2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。
3）切胶回收（尽量不要切到不含⽬的⽚段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。
4）回收产物电泳检测后进⾏连接：连接体系： 10×T4连接Buffer 1µl⽬的基因 6µl质粒载体 2µl产物酶切体系pPI9K 质粒酶切体系 DDW4.6µl DDW 7µl 10×HBuffer1µl 10×H Buffer 1µl ⽬的⽚段4µl pPI9K 质粒 1.6µl NotI quickcut 0.2µl NotI quickcut 0.2µlEcoRI quickcut 0.2µl(37℃15min) EcoRI quickcut0.2µl(37℃15min)T4 Ligase 1µl混合后16℃，过夜连接。
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限制修饰系统简称 R/M系统 restriction modification
类似于免疫体系，他能够识别自己的DNA和外来 的DNA，并使外来的DNA降解。 由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限制 性内切酶。 当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞 时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体 内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异 的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分 核酸还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化 核酸序列是限制性酶无法作用的。
酶切与连接
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸
二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解 断裂的蛋白酶。 分两类： 1 核酸外切酶，从核酸链的一端逐个水解核甘酸的 核酸酶。 2 核酸内切酶，能够水解核酸分子内磷酸二酯键 的核酸酶。
一 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割
（2）DNA甲基化的程度
核酸限制性内切酶是原核生物限制－修饰体系 的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲 基化作用，会强烈的影响酶的活性。通常从大 肠杆菌细胞中分离的质粒DNA，都混有特定核 苷酸序列的甲基化酶： 1 Dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残 基甲基化。 2 Dcm甲基化酶，催化cca\tgg序列中内部的胞 嘧啶残基的甲基化。 所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大 肠杆菌制备质粒DNA。
机理：
1、ATP（NAD）与酶结合产生 E－AMP＋ppi
即E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi
大肠杆菌DNA连接酶，E(酶)＋NAD+→E－AMP ＋NMN（烟酰胺单核苷酸）
2、E－AMP上的AMP转移到DNA的 5'－PO4上使其活化 3、活化的5`－PO4与相邻的3`－OH作用形成3` －5`磷酸二酯键，并释放出AMP。但连接酶不能 连接单链，必须要有模板的存在。也不能连接3` －OH和5`－PPP以及DNA与RNA。在后滞链的 合成，DNA损伤的修复，重组及转座中DNA连接 酶都发挥着重要的作用 。
1．简介 核酸限制性内切酶：是一种在特殊核甘酸序列处 水解双链DNA的内切酶 ，简称限制性酶。 限制性酶分三型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ Ⅰ型酶结合于识别位点并随机的切割识别位 点不远处的DNA，而Ⅲ型酶在识别位点上切割 DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ型限制酶的限制 修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组 成，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独 立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
B 平端DNA片断的连接
（1） 直接用T4ligase连接 （2） 同聚物加尾法 （3） 衔接物连接法
（1）直接用T4ligase连接
提高平末端连接效率常用措施 提高T4DNA连接酶浓度； 提高DNA片段浓度； 降低ATP浓度，以增强连接酶与DNA的结合； 加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA的静电排 斥力； 加浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、 强水化物三氯化六钴等。
二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接
核酸限制性内切酶将DNA分子切割为不同大小的 片断，然而要将不同来源的DNA片断组成新的杂 种DNA分子，还必须将他们彼此连接并且封闭起 来。
1．DNA连接酶
能够催化两个双链DNA片段相邻的5`端磷酸与3` 端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链 DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA 片段进行连接，是一种吸能反应，需要能源物质 NAD+或者ATP。DNA连接酶并不能连接两条单 链的DNA，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分 子的一部分。即封闭DNA缺口上的缺口 nick，而 不能封闭裂口gap 。DNA连接酶主要有两种：一 种是T4DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接 酶。
（5 ）限制性内切酶的缓冲液
缓冲液一般的组成部分包括：氯化镁、Tris-Hcl, 巯基乙醇或者二硫苏糖醇（DTT），牛血清蛋白 （BSA）等。 适合的二价金属离子浓度,通常为Mg离子。 适合的PH 通常为7.4左右。
限制性内切酶的星号活性
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性， 但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条 件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的 特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改 变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星 号表示，因此第二活性又称星号活性。概括起来， 诱导星号的因素有以下几种： 1,高甘油含量(>5%,v/v);2,限制性内切酶用量过高 (100u/ug DNA)；3,低离子强度(<25mmol/L);4,高 ph(8.0以上)；5,含有机溶剂，如DMSD,乙醇等， 6,有非Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）
例如:BamHⅠ和Bgl Ⅱ
BamHⅠ的识别序列 和切割位点：
Bgl Ⅱ的识别序列和 切割位点：
G↓GATC C C CTAG↑C
A↓GATC T T CTAG↑A
相连后，其序 再为原来的酶所切割。
3. 影响核酸限制性内切酶活性的因素
（2）同聚物加尾法
末端脱氧核苷酸转移酶，它能够将核苷酸加到 DNA分子单链延伸末端的3`-OH基团上。当只加 入DNA，dATP和末端脱氧核苷酸混合反应物时 产生poly A的尾巴。 加入dTTP 产生poly T尾巴。 这样两个用互补基团延伸过的DNA和载体，就能 连接在一起（相当于有了个粘末端）。
例如，Hind Ⅲ切割结果形成5`单链突出的粘性末 端；而Pst Ⅰ切割结果却形成3`单链突出的粘性 末端。 （2）形成平末端 有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的 DNA片段具有平末端。例如HpaⅠ切割结果形成 平末端。
Hind Ⅲ的识别序列是： 5`…A ↓ AGCT T…3` 3`…T TCGA ↑ A…5`
影响连接效率的因素： A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值 E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。
2．几种连接方式
A 用粘性末端DNA片断的连接 B 平端DNA片断的连接
A 用粘性末端DNA片断的连接
用特定限制性内切酶酶切过的质粒载体与以相同 酶酶切过的具有粘性末端的DNA片断连接。 载体可能自发的环化，这时可以用碱性磷酸酶处 理酶切过的质粒载体，移去末端的5`磷酸基团， 这样质粒载体就不能自发的环化了。而DNA片断 在与这种载体连接后，会留下一个3`-OH和5`-OH 的缺口，这种情况下仍然可以导入宿主菌。这种 分子在宿主菌中完成缺口的修复。
HpaⅠ的识别序列是： 5`…G ↓ TTAA C…3` 3`…C AATT ↑ G…5`
（3）限制片断末端的连接作用 许多种限制酶切割DNA分子形成的短片断能 够自发的重新环化起来。如果环化分子加热后又 会重新线性化。但是，如果马上使用连接酶处理， 使他们的3－OH基团和5—P基团之间封闭起来， 环化就是永久的了。 连接分为：分子间连接和分子内连接。
(3 )酶切消化反应温度
酶切标准温度是37℃，但是某些特殊的酶最适合 温度是例外的，比如SmaⅠ是30℃。 过高或者过低的温度会使内切酶失去活性。
（4） DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有 很大的影响。当DNA分子为线性的时候最容易， 当DNA分子存在二级结构的时候，酶切的活力就 会大大降低。
（3） 衔接物连接法
衔接物：指合成的两条互补的寡核苷酸，使其配 对后一端为平末端，另一端为为黏性末端，或两 端为不同的黏性末端的片段。 衔接头可以使DNA片段的平末端转变为黏末端， 或由一种黏末端转变为另一种黏末端，并且无需 用限制酶切。 例如：EOCRI-SMAI平末端衔接物 5`…AATTCCCGGG…3` 3`…GGGCCC…5`
2．Ⅱ型限制性内切酶的基本特性
Ⅱ型限制性内切酶的识别序列通常由4~8个碱基 对组成，它们具有二重旋转对称轴，这些碱基对 的序列呈回文结构。所以限制酶切割DNA后，均 产生含5`磷酸基和3`羟基的末端。限制酶作用所 产生的DNA片段有以下两种形式： （1）形成黏性末端 不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结 果形成的DNA限制片段具有黏性末端。
（1）DNA 纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液
（1）DNA 纯度
污染在DNA制剂中的某些物质，例如：蛋白质、 酚、酒精、异丙醇、EDTA、高盐离子等。所以 在纯化过程中，空摔一定要时间充足，要彻底； 用微碱的TE洗脱； 提高限制内切酶的用量； 延长酶切时间； 扩大酶切体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释。
同裂酶和同尾酶
同裂酶是指一些来源不同的限制酶识别位点和切 割位点的核苷酸靶序列完全一样。产生同样的切 割，形成同样的末端。 同尾酶对应一类限制酶，他们虽然来源各异，识 别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末 端。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后 所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别 和切割。