实验16-酶切与连接
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
酶切注意事项及问题
一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常,一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶不言而喻,选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物.假设一个GC含量50％的DNA链,一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基的酶将平均在每46(4096）碱基切割一次.内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端)，也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上.酶应当是最后一个被加入到反应体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如,超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割.参见目录第244和264之”切割质粒DNA”和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染,以免干扰酶的活性。
DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。
关于甲基化的内容,参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液,可保证几乎100％的酶活性。
使用时的缓冲液浓度应为1X。
有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。
在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。
实验酶切与连接
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原因
1. 内切酶失活
2. DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等 内切酶抑制因子
3. 条件不适（试剂、温度）
4. DNA酶切位点上的碱基被甲基化
对
5. DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn 策
I）
6. DNA位点上存在其它修饰
7. DNA不存在该酶识别顺序
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用 而“粘合”。
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别 位置是：
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用 而“粘合”。
一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原 核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ侵袭。
EcoRI PrimerGST6p1-APOA1-down: 5’ CGCGTCGACTCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3’
SalI
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。
质粒DNA及λDNA的酶切分子生物学实验
质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法二、实验原理:外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术,这样重新组合的DNA分子叫做重组子;重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源DNA分子连接连接连接连接起来;将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中,将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养,可以通过αααα互补筛选法互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子,并可通过酶切酶切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及PCRPCRPCRPCR检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴定;1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱,选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点,否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA 时不能得到完整的目的基因;其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子;常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种;本实验采用单酶切法,即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段,酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端,再选用同样的限制性内切酶处理载体;在构建重组子时,除了形成正常的重组子外,还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中,或目的DNA串联后再插入载体分子中,甚至出现载体分子自连,重新环化的现象;单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂;各种限制性内切酶都有去最佳反应条件,最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成,在双酶切体系中,限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐,先低温后高温”的原则进行反应;要达到高效率的连接,必须酶切完全,酶切的DNA数量要适当;另外,酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量,以及相应的所需酶的量;可以适当增加酶的用量,但是最高不能超过反应总体积的10%,因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中,如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%,就会抑制酶的活性;连接反应总是紧跟酶切反应,外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的;DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键;在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4DNA连接酶,它可以连接黏性末端和平末端;连接反应时,载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:1~3之间,可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象;反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间,一般是16℃,用常用的连接时间为12-16h;2.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化;能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞,即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态,它决定于受体菌的遗传特性,同时与菌龄、外界环境等因素有关;人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力,或人为地将DNA导入细胞内,该过程与细菌自身的遗传控制无关,常用热击法,电穿孔法等;能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关,所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株;目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法,制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油,-70℃可保存半年至一年;经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加,允许外源DNA分子进入;在低温下,将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合,经过热击或电穿孔技术,使载体分子进入细胞;进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达,使受体细胞出现新的遗传性状;将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养,即可筛选出重组子;本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞,用CaCl2处理,使其处于感受态,然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s,实现转化;3.重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后,并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子,一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖;并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起;再者,在这些被转化的受体细胞中,除部分含有我们所期待的重组DNA分子外,另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致;因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子,并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子;本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法;抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选,而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活,α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子;质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因Ampr,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子;没有导入质粒PUC19的受体细胞,在含有氨苄青霉素的平板上不生长;质粒PUC19进入E.coliDH5α后,通过α-互补作用,形成完整的β-半乳糖苷酶;在麦康凯培养基平板上,转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸,pH降低,培养集中的指示剂变红,转化子的菌落变红;不含质粒的E.coliDH5α,没有β-半乳糖苷酶活性,不能利用培养集中的乳糖产生有机酸,而是利用培养集中的有机碳源,不使培养基pH降低,在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落;重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部,不能形成α-互补作用,所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸,在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落;挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落,通过扩增培养;因为许多菌落存在假阳性情况,在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA 菌落,也可能是载体自连后发生突变的菌落,所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小,可将重组的载体DNA提取出来,进行后续的酶切、电泳检验;也以提取的重组质粒为模板,利用现有的引物,进行那个PCR扩增,检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒;4.PCR技术PCRPolymerasechainreaction即聚合酶链式反应,其原理类似于DNA的体内复制,又叫做“体外基因扩增”;反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+,4种脱氧核糖核酸dNTP、DNA聚合酶和合适的缓冲体系;反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程;这三个反应构成一个循环,反复进行;每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板;理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍,反复30次,特异DNA序列片段以指数方式可扩增105~106;通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR产物,因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术;现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的TaqDNA聚合酶,而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率;反应中用的引物有两段,一条称为上游引物或者正向引物,一条称为下游引物或者反向引物;引物的设计十分重要,在设计时应遵循以下原则：长度一般为18到24个碱基；G+C的百分含量在40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构,避免形成引物二聚体；最好以1到2个G或C碱基开始或结束；引物的5’端可以被修饰,但是3’端绝对不能进行任何修饰,而且引物的3’端要避开密码子的第三位;模板的浓度不能太大,dNTP的浓度为2.5mmol/L,金属离子的浓度为1.5mmol/L,缓冲液为pH为7.2~8.0的Tris —HCl溶液;二、实验材料：1.菌株：E.coliDH5α2.培养基：LB培养基、麦康凯培养基加入氨苄青霉素3.试剂材料：酶切反应：DNAPUC19质粒,酶切10×buffer,HindⅢ,重蒸水,λDNA;连接反应：酶切后的DNAPUC19质粒和λDNA,连接10×buffer,T4连接酶,重蒸水;感受态细胞的制备：0.1MCaCl2转化：连接液和感受态细胞,0.1MCaCl2,冰块;重组菌的挑选、检验：试剂盒含有RnaseA的溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer,酶切后的DNAPUC19质粒,试剂盒抽提的DNA,酶切10×buffer,HindⅢ,重蒸水,琼脂糖,TAE缓冲液;上样缓冲液,EB染液;PCR检测：10×PCRbuffer,dNTP,模板,引物1,引物2,水,TaqDNA聚合酶,琼脂糖,TAE、溴化乙锭EB4.仪器器材：20、200、1000ul的枪和枪尖,1.5ml的Ep管,恒温培养箱,水浴锅,平板,三角瓶,试管,接种环,牙签,酒精灯,火柴,冰箱,离心机,电泳槽,紫外仪,PCR扩增仪三、实验步骤载体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与电泳检测→PCR检测一酶切1、在两支Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分,混匀,适当离心,使样品集中于管底；酶切反应各成分添加如下：2、在37℃恒温水浴锅中反应1h以上;3.分别取上述酶切样品2~5uL,与1~2uL电泳上样缓冲液混合均匀,进行琼脂糖凝胶电泳,观察酶切反应是否彻底,剩余样品可以继续酶切;4.待电泳观察酶切反应完全后,将剩余样品从恒温水浴锅中取出,置65℃恒温水浴锅中保存10~15min,终止酶切反应5.样品可以直接进行酶切反应或者保存于-20℃冰箱备用二连接1、在Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分,混匀,适当离心,使样品集中于管底；连接反应各成分添加如下：3、连接产物可用于转化实验;三感受态细胞的制备1、用接种环从含有E.coliDH5α的培养基平板上挑取少量灰白色E.coli菌落接种到20mlLB培养基里,37℃振荡培养过夜;实验均在无菌条件下,以防污染；2、取37℃过夜培养物,此时的培养物较浑浊,颜色变深;按1%的接种量吸取200μl转接到20mlLB培养基中,37℃振荡培养2.5~3小时；3.分别取1.5ml菌液于2个无菌的1.5mlEppendorf管中,5000rpm离心5min,弃上清液,吸干；重复收集菌体一次,使菌量增多；每支离心管中加入用冰预冷的1ml0.1mol/lCaCl,漩涡震荡使细胞悬浮混匀,冰上放置15min,4℃5000rpm离心5min；4、弃上清液,吸干后,加入100ulCaCl悬浮冰浴至使用；上述方法制好的感受态细胞置于冰上,48h之内均可用于转化,分装成2x50ul和100ul三管;四转化实验1、取制备好并摇匀后的3管感受态细胞悬液,分别作如下处理：1感受态细胞悬液50uL+pUC19质粒DNA1uL2感受态细胞悬液50uL+DH5a3感受态细胞悬液100uL+连接产物5uL2、将以上各样品管轻轻摇匀,冰浴10min,在42℃水浴中热击90s,然后迅速置于冰上2~3min,质粒已经吸附到感受态细胞的表面,此时不能剧烈振荡,以增加转化效率；3、向上述3管中分别加入450ul、450ul和900ul新鲜的LB培养基混匀后,37℃摇床培养1~2h,使受体菌恢复正常生长状态;五稀释和涂布平板1、无菌操作,将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：⑴受体菌对照管：取50ul受体菌液分别涂布含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基；⑵pUC19质粒对照组：取50ul培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基；⑶重组质粒转化组：取50ul、100ul、150ul、200ul培养液分别涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基2、当菌液完全被培养基吸收后大约10min倒置培养皿,于37℃恒温培养24~36h,观察菌落生长情况红白菌落法;六重组子的筛选与鉴定1、取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板,在底部划线分成6个区域；在涂有重组质粒转化组的平板上分别选取6个单个的白色转化子,用接种针划线转接到平分成6份的含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上；37℃过夜培养；2、在划线的6个单菌落中选取4个,分别接种到含有5ml带氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜；七试剂盒抽提重组质粒DNA及鉴定1、分别取3ml菌液,用Omega试剂盒抽提重组质粒DNA,具体步骤见说明书；2.将pUC19质粒酶切及两组重组质粒酶切体系加入10loadingbuffer,混合均匀,进行琼脂糖凝胶电泳,电泳1h左右;1~2uL样品+1~2uLLB+1~2uL水注意事项1.本实验属于微量操作,用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中;2.实验中所用塑料器材都必须是新的,并且经过高温灭菌,操作时打开使用,操作过程中要注意环境干净,戴手套操作,尽量减少走动,缩短Ep管开盖的时间;3.不论是酶切还是连接反应,加样的顺序应该是,先加双蒸水,其次是缓冲液和DNA,最后加酶;且前几步要把样品加到管底的侧壁上,加完后用力将其甩到管底,而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出,酶管放置冰上,取酶液时吸头应从表面吸取,防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液;取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下,并充分混匀;4.Ep管的盖子应盖紧,防止水浴过程中水汽进入管内,并做好标记以防样品混淆;5.转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染,整个操作过程应在无菌条件下进行;6.电泳时使用的缓冲液最好是现配现用,以免影响电泳效果;7.制备凝胶时,应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长,否则溶液将会暴沸蒸发,影响琼脂糖浓度;制胶时要除去气泡;拔梳子时要特别小心,以防凝胶与支持物脱离;8.上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿;也不要快速挤出吸头内的样品,避免挤出的空气将样品冲出样品孔;9.溴化乙锭是一种强烈的诱变剂,有毒性,使用含有这种染料的溶液时,应带上乳胶手套进行操作;勿将溶液滴洒在台面上,实验结束后用水彻底冲洗干净;10.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害,对眼睛尤甚;观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽,并应戴好目镜或眼罩,避免皮肤直接暴露在紫外线下;11.实验中加样后应及时更换吸头,以避免试剂的污染;12.PCR反应高度灵敏,应设法避免污染,如戴一次性手套操作,使用一次性PCR管和吸头,反应加样区应与DNA模板制备区及PCR产物电泳检测区分开;13.PCR管单加样时,对于非常微量的样品一定将样品加在管壁上或者液体中,防止漏样;14.实际操作时,为了防止少加样,可以保存每次用过的枪尖,通过数枪尖知道自己加到哪一步了;五、结果与分析1、pUC19质粒DNA酶切结果目的基因与pUC19质粒载体酶切以后经过琼脂糖凝胶电泳,紫外成像如下：从左到右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII；第2、3泳道：λDNA及λDNA/HindIII；第4、5泳道：pUC19质粒及pUC19/HindIII；第6-15泳道：第1-10组的pUC19/HindIII样品；第16泳道：pUC19/HindIII；第17泳道：λDNA/HindIII；我所在组为第9组,为第14泳道所电泳样品;对比酶切时的Marker和商业酶切质粒,可知带①为线性pUC19质粒,带②基本上为未切开的双螺旋pUC19质粒;对比带①与带②可以发现,带①的亮度和宽度仅为带②的一半左右,所以说明有三分之二的双螺旋质粒没有被切开,具体原因可能为：酶切时间短；酶活性较低；酶切反应的buffer不合适等;2、转化结果质粒转化进入感受态细胞后,在培养基上进行涂布并过夜培养,第二天观察培养基培养情况;表4平板内菌落的正确生长状况但是我们组的平板内全部有很多菌落生长,可能原因有：1.操作不当,涂布时有其他液体混入2.氨苄失活3、重组质粒的筛选与鉴定1重组质粒进行酶切以后,进行琼脂糖凝胶电泳,得成像如下图本组使用的重组质粒来自其他组从左至右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII；第2泳道：pUC19质粒；第3-22：第1-10组的重组质粒R,R；我所在组为第9组,重组质粒为第19、20泳道;通过对比可以看出两个重组质粒连接的应该都是125bp的小片段六、实验小结1、总结与反思⑴溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套;⑵酶切反应的所有塑料制品Eppendorf管、吸头等必须是新的,并经过高温灭菌,操作时打开使用,操作过程不要求无菌,但要注意手和空气中杂酶的污染,因此要求环境干净,戴手套操作,尽量减少走动,缩短Eppendorf管的开盖时间；⑶感受态细胞必须从纯菌种开始;从划线纯化的单菌落开始,进行活化培养,不要使用多次转接或储存在4℃的培养菌液,其目的是为了保持菌株的纯度和活力；⑷培养时间：过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况;如果出现了问题,调整培养时间会有帮助：染色体断裂多,则增加培养时间；酶切出现问题,则减少培养时间；⑸菌体的彻底悬浮：如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在SolutionII加入后,变成一个外围几乎彻底裂解,往里不完全裂解,中间没有裂解的团块;这个团块在SolutionIII加入后,会有一部分蛋白质继续存在于溶液中,成为蛋白质残留的最大根源；⑹使用相对过量的试剂：这是适合所有核酸抽提的建议;试剂相对过量的好处是：稳定性好,纯度高,操作更简单;如果认为这样不经济,就少用一点菌体；⑺配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶,琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓；⑻限制性内切酶的酶切反应属于微量操作技术,无论是DNA样品还是酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系；2、思考题1从电泳图上如何判断质粒DNA是否单酶切完全答：没有酶切的质粒处于超螺旋状态,因此在电泳图上原则上只能看到超螺旋条带;单酶切后质粒处于线状,如果单酶切不完全可能出现超螺旋状态和线状质粒条带同时存在,可以添加原质粒未酶切样品及同种质粒酶切完全样品做Maker,通过对比单酶切后的质粒条带是否单一及是否为线性进行判断;2影响质粒DNA转化效率的因素有哪些答：准备用来制备感受的细菌的生长状态与密度,制备感受态时细菌应处于对数期或者对数前期；质粒DNA的数量、大小与构型,质粒DNA数量不应太多,而分子量越大的质粒转化效率越低,超螺旋质粒DNA的转化效率高于重组DNA,环状DNA转化效率高于线性DNA；进行转化所用的试剂的纯度、质量和器材的洁净程度；数否杂菌及外源DNA污染;。
改造质粒载体的原则和方法
改造质粒载体是一种常见的分子生物学实验技术，用于构建和优化基因工程中的质粒。
以下是改造质粒载体的一般原则和方法：
原则：
选择合适的质粒载体：根据实验目的和需求，选择适当的质粒载体。
常见的质粒载体包括质粒背景、表达载体、报告载体等。
插入目标基因或片段：将感兴趣的目标基因或片段插入到质粒载体中，以实现特定的实验目的，如基因表达、功能分析等。
确保稳定复制：确保质粒具有稳定的复制和拷贝数，以保证基因的传递和稳定性。
方法：
酶切与连接：使用限制性内切酶切割质粒载体和目标DNA片段，生成兼容的末端，然后使用DNA连接酶将目标DNA片段与质粒载体连接。
PCR扩增：利用聚合酶链反应（PCR）扩增目标基因或片段，然后通过连接酶反应将其连接到质粒载体上。
引物扩增与酶切：设计引物扩增目标基因或片段，然后通过酶切与连接方法将其插入质粒载体。
重组和转化：利用重组技术，如化学转化、电转化或热激转化，将改造后的质粒导入宿主细胞中。
验证和筛选：
验证插入：通过PCR、酶切、DNA测序等方法验证质粒中的目标基因或片段是否正确插入。
筛选转化子：使用选择性培养基或筛选标记基因，筛选出成功转化并带有目标基因的细胞克隆。
质粒的酶切、连接、与转化
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转载▼质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。
质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。
T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。
当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。
（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。
点突变、酶切、连接实验-1
2017-12-6酶切实验：按照上表加入试剂，置于37℃孵育过夜，第二天早上跑胶回收，做连接。
连接实验：按照上表加入试剂，置于4℃孵育30min-60min（通常孵育45min-50min），加入1μL EDTA/5min 终止连接，接着做转化（感受态细胞）转化1、将上诉连接完的产物加入到50μL（每管100μL/200μL）的感受态细胞中，于冰上20min；2、于42℃水浴锅上热激1min —1min30s，取出置于冰上4℃，5min；3、加入200μL LB培养基，于37℃摇床孵育30min；4、孵育完之后涂布在LB平板（LB平板在37℃培养箱中吹干水）（A+氨苄抗性）上。
将孵育16-18h的LB平板取出，观察菌落大小，将菌落编号（尽量取单数，因为这个时候可能已经有些克隆在PCR （PB2/PB1/PA/HA/NA/NP/M/NS）时候有可能突变）接着进行菌落PCR，再将PCR产物进行琼脂糖电泳，确认该菌落是否是目的菌落。
PCR程序：95℃3min（2-3min是为了让大肠杆菌破裂释放核酸，如果95℃只设定了30s则大肠杆菌没法破裂，核酸释放不出来，PCR则很可能不成功；但是如果设立的时间为5min 则时间过于长，对酶不好）；95℃30s，55℃30s；72℃1min30s，cycle x 30-35；72℃7min。
点突变（2017-12-18）：设计引物：从需要突变的点左边和右边各选择12个碱基，碱基尽量以GC结尾（尽量不要以AT结尾）Sample（PR8 HA质粒）PCR体系（所用酶为PFu（F 530S （100））PCR程序：95℃30s；95℃30s，50℃（50-55）1min，68℃5min（载体3kb+ HA 1.7kb，该酶的效率为1kb/1min）cycle x 12-18（时常设定为15-18）；72℃5min。
待PCR完毕，加入1uL DpnI（这种酶能特异性识别甲基化位点，当质粒进入细菌后会产生甲基化位点，所以新生成带突变位点的产物是不会被酶切的），置于37℃过夜（17：00放入孵箱，第二天早上8：00取出），接着做连接。
酶切注意事项及问题
1、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。
DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。
关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。
使用时的缓冲液浓度应为1X。
有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。
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各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位臵上切割双 链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位臵是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成
反应体系： 载体 DNA 100ng 插入片段DNA 17ng 连接酶 10X 缓冲液 1μl T4 DNA 连接酶 (Weiss 单位) 0.1–1u 无核酸酶水加至 10ul 2. 孵育反应于：室温下3 小时，或4°C 过夜，或15°C，4–18 小时。
实验步骤与试剂（酶切）
反应体系 1. 质粒pUC18 DNA 2. PCR产物 3. HindⅢ内切酶 4. Hind Ⅲ 10 X buffer 2μl 2μl 2μl 2μl
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
３．反应缓冲液： 反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为 内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
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连接反应---连接酶（ligase）
ligase 又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或 把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应 相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP) 的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等
连接酶的催化反应过程需要Mg离子
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来 ＤＮＡ侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
5. ddH2O
反应步骤 1. 37°C
12μl
总体系为20 μ l，混匀 酶切2h
2. 65°C
灭活10min
3. 琼脂糖电泳检测
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原 因
1. 2.
1. 2. 3.
标准底物检测酶活性 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 检查反应系统是否最佳
原 因
1. 2. 3.
1.
保存温度不合适 以稀释形式保存 贮藏缓冲液不适当
内切酶贮藏在含50%甘油的 贮藏液中，应在-20℃低温保 存 稀释酶液不宜长期存放，应一 次使用 使用厂家推荐的贮藏缓冲液 内切酶与500ug/ml的BSA一起 保存
2.
4.
低蛋白浓度
对 策
3. 4.
DNA电泳常见问题分析
问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原 因
1.
2. 3.
1.
内切酶星状活性
其它内切酶污染 底物中含其它DNA杂质
对 策
检查反应条件：甘油浓度大于12% ，盐度过低，Mn2+的存在及酶： DNA值过大均均可导致星状活性 ，降低酶的用量 用λDNA作底物检查酶切结果 电泳检查DNA，换用其它酶切， 纯化DNA片段
2. 3.
限制性内切酶酶切常见问题分析
原 因
1.
2.
DNA上结合有蛋白质
内切酶中含有DNA外 切酶
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1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别 位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一 性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK等。 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
结构的三大要素： • • 多克隆位点
选择标记（耐药性，LacZ）
• 独立的复制单位
由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
（二）材料
模板DNA 引物：APO A1-GST2(载体：pGEX-6P-1) PrimerGST6p1-APOA1-Up: 5’ GGAATTCATGGATGAACCCCCCCAGAGCC -3’ EcoRI PrimerGST6p1-APOA1-down: 5’ CGCGTCGACTCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3’ SalI
3.
4. 5.
同上
同上 反应前离心数秒
6.
7.
将内切酶稀释，增大取样体积
电泳前将样品臵65℃保温5-10分 钟，取出后臵冰浴骤冷 使用标准反应缓冲液及温度，避 免强烈振荡 适当稀释酶液，反应液稀释的酶 不能贮藏
对 策
8.
9.
10. 11.
使用最佳反应体系
加大酶量5-10倍
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题三：DNA片段数目多于理论值
内切酶失活 DNA不纯，含有SDS，酚 ，EDTA等内切酶抑制因子
4.
换用对DNA甲基化不敏感的同裂 酶酶解，重新将质粒DNA转化至 dcm-，dam-基因型的细菌菌株
换用不同切割非甲基化位点的同裂 酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌 株中扩增 将DNA底物与λDAN混匀进行切 割验证 换用其它的酶切割DNA或过量酶 消化进行验证
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
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2. 限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 (Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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实验十 限制性酶切与连接
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载体（Vectors）
一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我 复制的DNA 分子称为Vectors. 主要载体：质粒、噬菌体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。 随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功 能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。
Yes
No
Ⅲ类
二 亚 基 双 5-7 bp 非 在 识 别 位 功能酶 对称 点下游 2426bp
Yes
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Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同 的切口－－５’端突出、３’端突出和平 末端。 限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人 们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进 行改造，从而极大地推动了分子生物学的 兴旺和发展。
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位臵切割后生成 5’……G 3’……CTTAA AATTC……3’ G……5’
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1. 限制性内切酶的类型
第二类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出、３’端突出和平末端。 限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目 的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生 物学的兴旺和发展。
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粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位臵切割后生成 5’……G 3’……CTTAA AATTC……3’ G……5’
3.
4.
条件不适（试剂、温度）
DNA酶切位点上的碱基被 甲基化 DNA酶切位点上没有甲基 化（如Dpn I） DNA位点上存在其它修饰 DNA不存在该酶识别顺序
5.
5.Leabharlann 对 策6.6. 7.
7.
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题二：DNA切割不完全
原 因
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.