酶切
实验六-酶切
五、利用限制性内切酶克隆
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设
计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同 酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸 露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加 上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对 其识别位点进行有效切断。 酶切位点（内切酶的识别序列）要加在引物的 5‘端 具体为：5'-保护碱基+酶切位点+引物序列-3'
四、使用限制酶注意事项
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进
一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各 自的最适盐浓度。 若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先 使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。 也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后臵-70℃低温 冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶 切反应。
割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。
第二类内切酶
酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸
识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴
同尾酶；切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的 一类限制性内切酶。
这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相
同的粘性末端。 由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补 作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限 制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在， 不能被原来的限制性内切酶所识别。
酶切原理及步骤
酶切原理及步骤一、酶切原理1.酶切反应酶切反应是指使用酶作为催化剂，对底物进行切割或降解的反应。
在酶切反应中，酶的活性中心与底物特异性结合，通过催化作用将底物分解成小分子片段。
2.酶切位点酶切位点是指酶与底物特异性结合的部位。
不同的酶具有不同的酶切位点，通常由特定的氨基酸序列组成。
3.酶切动力学酶切动力学描述了酶切反应的速度和底物浓度之间的关系。
在一定条件下，当底物浓度高于某一阈值时，反应速度将达到最大值。
二、酶切步骤1.酶液准备在进行酶切实验前，需要准备适量的酶液。
根据实验需求选择合适的酶种类和浓度。
通常，酶液需要在冰箱中冷藏保存。
2.样品准备将待测样品进行预处理，以便与酶液混合后进行反应。
样品处理方法因实验而异，常见的处理方法包括细胞破碎、蛋白质提取等。
3.酶切反应设置将准备好的酶液和样品混合，加入适量的缓冲液（如pH 7.4的Tris-HCl缓冲液），设置反应温度和时间。
4.酶切反应温度和时间设置根据所选酶的活性要求和实验条件，设置适宜的反应温度和时间。
通常，适宜的反应温度为37℃，反应时间因底物种类和浓度而异。
5.反应终止和产物检测在反应结束后，需要终止反应并检测产物。
常用的终止方法包括加入酚/氯仿抽提、加热或加入抑蛋白剂。
产物检测方法因实验而异，常见的检测方法包括蛋白质印迹、电泳、光谱分析等。
三、酶切实验设计1.酶种选择2.根据实验需求选择合适的酶种类。
不同的酶具有不同的特异性，需要根据目标蛋白质序列选择具有相应酶切位点的酶。
同时还需要考虑所选酶的活性、稳定性和安全性。
3.实验条件优化在进行酶切实验前，需要对实验条件进行优化。
主要包括底物浓度、缓冲液pH值、离子强度、反应温度和时间等方面的优化。
通过调整实验条件可以提高产物的产量和质量。
4.产物检测方法选择根据实验需求选择合适的产物检测方法。
常用的检测方法包括蛋白质印迹、电泳、光谱分析等。
需要根据目标产物性质选择适宜的检测方法以便于后续分析。
酶切体系300ul
酶切体系300ul酶切体系是分子生物学实验中常用的一种技术，它主要用于将DNA或RNA分子切割成特定大小的片段。
在一个典型的酶切体系中，通常包括以下几个部分：酶切缓冲液、酶切酶、模板DNA或RNA、以及相应的标记物。
下面我们将详细介绍酶切体系的组成、酶切过程中的注意事项以及酶切后的产物处理与应用。
一、酶切体系的组成及作用1.酶切缓冲液：酶切缓冲液为酶提供了一个稳定的反应环境，包括适当的pH值、离子浓度和温度。
不同的酶切缓冲液配方适用于不同类型的酶切反应，如常规的DNA酶切缓冲液、RNA酶切缓冲液等。
2.酶切酶：酶切酶是酶切反应的核心成分，它能够识别特定的核苷酸序列，并将模板DNA或RNA切割成特定大小的片段。
根据酶切酶的种类和切割位点，可以将酶切体系分为两类：内切酶切体系和外切酶切体系。
3.模板DNA或RNA：模板DNA或RNA是酶切反应的起始物质，实验者根据研究需求选择合适的模板进行酶切。
在酶切反应中，模板DNA或RNA会被酶切成不同大小的片段。
4.标记物：酶切后的产物通常需要进行检测和分离，此时需要加入相应的标记物，如荧光标记物、放射性标记物等。
标记物可以帮助实验者快速检测和分离酶切产物。
二、酶切过程中的注意事项1.酶切的温度和时间：不同的酶切酶对温度和时间的要求不同，实验者需根据酶切酶的说明书进行精确控制。
一般来说，酶切反应的温度范围在37℃至65℃之间，时间则在30分钟至几小时不等。
2.酶切反应的浓度：酶切反应的浓度会影响到酶切效果，实验者需要根据研究需求和酶切酶的特性调整反应体系的浓度。
3.酶切过程中的搅拌和速度：酶切过程中，适当的搅拌和速度有利于酶与模板的充分接触，提高酶切效率。
4.避免酶污染：酶切过程中要严格防止酶污染，可以使用酶标仪、灭菌器材等设备，确保实验的准确性。
三、酶切后的产物处理与应用1.酶切后的产物检测：酶切后的产物可以通过电泳、测序等方法进行检测和分析。
实验者需根据研究需求选择合适的检测方法。
酶切注意事项
酶切注意事项嘿，朋友们！今天咱来聊聊酶切那些事儿。
酶切啊，就像是一场精细的手术，可不能马虎哟！你想想看，酶就像是一把特别的小剪刀，要在特定的地方把 DNA 咔嚓剪开。
这可不是随便乱剪就行的，要是剪错了地方，那可就糟糕啦！就好比你要剪一件衣服，得找对位置剪，不然好好的衣服不就毁了嘛。
首先呢，你得选对酶。
不同的酶有不同的脾气和喜好呢，有的喜欢这个序列，有的喜欢那个序列。
所以啊，在开始之前，一定要好好研究清楚，可别瞎选哟！这就跟找对象似的，得找个合适的，不然相处起来多别扭呀。
然后呢，反应条件也很重要。
温度啦、pH 值啦，这些都得把握好。
温度太高，酶可能就被热坏啦；温度太低，酶可能又懒得干活。
pH 值不合适的话，酶也会不高兴的哟。
这就像人一样，在舒服的环境里才愿意好好工作嘛。
还有啊，酶切的时候用量也得注意。
用少了吧，切不完全；用多了吧，又浪费。
这就跟做菜放盐似的，放少了没味道，放多了又咸得没法吃。
再有就是反应时间啦。
太短了可能没切完，太长了又怕酶把不该切的地方也给切了。
这就像跑步比赛，跑太快容易摔倒，跑太慢又赢不了比赛呀。
另外，可别小瞧了那些杂质哦。
一点点杂质都可能影响酶切的效果。
就好像一碗汤里掉进了一粒沙子，那喝起来感觉可就差远啦。
而且呀，做实验的时候一定要仔细再仔细。
别毛手毛脚的，把试剂弄洒了或者搞错了顺序，那可就前功尽弃咯。
这就像搭积木，一步错步步错呀。
总之呢，酶切虽然看似简单，里面的学问可大着呢！大家一定要认真对待，多积累经验，这样才能保证实验的成功呀。
可别不当回事儿，不然到时候哭都没地方哭去！酶切可是很重要的一步，它关系到后续的实验能不能顺利进行呢。
所以呀，大家一定要好好记住这些注意事项，让我们的酶切实验顺顺利利的，加油吧！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
DNA酶切技术
DNA酶切技术DNA酶切技术是一种重要的分子生物学技术，它可以在DNA分析、基因工程和遗传学研究中起到关键作用。
该技术利用特定的酶切酶将DNA分子切割成特定的碎片，从而实现对DNA分子的重组、分析和修饰。
本文将介绍DNA酶切技术的原理、应用和发展趋势。
DNA酶切技术的原理主要基于酶切酶对特定的DNA序列具有识别和切割的能力。
酶切酶通常识别并切割具有特定核酸序列的DNA，这些序列被称为酶切位点。
酶切位点是DNA分子的特定地方，它们的序列可以是4至8个碱基对长度，也可以是更长。
酶切酶一般切割酶切位点或位于附近的特定位置，产生两个具有粘性末端或平滑末端的DNA片段。
粘性末端具有未饱和碱基对，在特定条件下可以与其他DNA片段连接起来，而平滑末端则不能。
这使得DNA酶切技术可以实现DNA片段的分离、重组和修饰。
DNA酶切技术在许多领域中有着广泛的应用。
在基因工程研究中，通过酶切技术，可以将感兴趣的基因从一个DNA分子中切割出来，并将其插入到另一个DNA分子中，实现基因的互换和重组。
这为研究基因功能、制备重组蛋白和构建转基因生物等提供了基础。
此外，DNA酶切技术还广泛应用于DNA分析和诊断。
通过酶切技术，可以快速准确地检测和鉴定DNA样本中的特定序列，如基因突变、DNA指纹和基因多态性。
这对于遗传病的诊断、个体识别和法医学检验等具有重要意义。
近年来，DNA酶切技术取得了许多新的进展和突破。
一方面，酶切酶的种类不断增加，并且常常能够识别更具有特异性的酶切位点。
这使得酶切酶能够更准确、高效地切割DNA分子，并实现更复杂的重组和修饰。
另一方面，DNA酶切技术的操作方法也得到了改进和优化。
传统的DNA酶切技术需要大量的DNA样本和复杂的实验步骤，但随着技术的发展，已经出现了高效、快速的DNA酶切技术，如聚合酶链反应（PCR）和分子克隆等。
这些新技术不仅能够减少DNA样本的需求和实验时间，还可以在不同领域中更广泛地应用。
酶切不彻底的原因
酶切不彻底的原因
酶切不彻底可能有多种原因，具体如下：
1.酶切位点不完全匹配：酶切位点是酶识别并切割DNA或RNA的特定序列。
由于序列的突变或变异，酶与酶切位点之间可能存在一定程度的不匹配，导致酶无法完全切割底物。
2.酶切条件不理想：酶的活性受到多种因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。
如果这些条件没有得到精确的控制，可能会影响酶的活性，导致不完全酶切。
3.酶量不足：酶量不足会导致其无法完全完成切割反应。
4.蛋白质与DNA样品结合：在某些情况下，蛋白质可能会与DNA样品结合，这可能会阻止酶与DNA的充分接触，从而导致酶切不彻底。
5.酶活力不足：如果酶的活力不足，其切割能力就会受限，可能导致酶切不彻底。
6.外切核酸酶污染：如果反应体系中存在外切核酸酶，它可能会降解已切割的DNA片段，导致酶切产物不完整。
酶切用的酶
酶切用的酶简介酶切是分子生物学研究中常用的一种技术手段，用于切割DNA分子。
酶切用的酶是一类特殊的酶，能够识别特定的DNA序列并将其切割成特定的片段。
在基因工程、DNA测序和DNA重组等领域，酶切用的酶发挥着重要的作用。
酶切原理酶切用的酶主要是一类特殊的内切酶，也叫限制性内切酶（Restriction Enzyme）。
它们能够识别DNA分子中的特定核酸序列（酶切位点），并在该位点上进行切割。
酶切位点通常是一个对称的序列，例如5’-GAATTC-3’。
酶切用的酶能够识别并切割这样的序列，产生两个粘性末端或平滑末端的DNA片段。
酶切用的酶具有高度的特异性，即只能识别特定的酶切位点。
它们通过与DNA分子中的特定序列进行互补配对，形成酶-底物复合物，然后在酶切位点上切割DNA链。
酶切用的酶的分类根据酶切位点的序列特征，酶切用的酶可以分为不同的类别。
常见的酶切用的酶包括：1.限制性内切酶I类（Type I）：这类酶切用的酶切割DNA时具有两个酶切位点，但切割位点与识别位点并不重合。
它们通常在识别序列附近的随机位置进行切割，产生不规则的切口。
2.限制性内切酶II类（Type II）：这是最常用的一类酶切用的酶。
它们能够直接在识别位点进行精确的切割，产生具有平滑末端或粘性末端的DNA片段。
常见的II类酶切用的酶有EcoRI、HindIII等。
3.限制性内切酶III类（Type III）：这类酶切用的酶切割DNA时具有两个酶切位点，与Type I类酶相似。
它们也将切割位点与识别位点分开，产生不规则的切口。
与Type I类酶不同的是，Type III类酶需要与其他辅助蛋白一起作用才能发挥酶切功能。
4.限制性内切酶IV类（Type IV）：这类酶切用的酶不常见，它们不在识别位点进行切割，而是在较远的位置附近进行切割。
5.限制性内切酶V类（Type V）：这类酶切用的酶是一类泛素修饰酶（Methylase）。
它们不能直接切割DNA链，而是在酶切位点上对DNA进行甲基化修饰。
做酶切时要注意些什么？
做酶切时要注意些什么？做酶切时要注意些什么？酶切后跑电泳无条带可能是什么原因？（排除电泳因素）参考见解：一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg 已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。
DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。
关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。
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•DNA的酶切实验采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。
酶切可以是单酶切也可以是双酶切。
单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。
具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。
一材料、试剂和仪器：1 材料：质粒DNA2 试剂：限制性内切酶、ddH2O3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪实验程序：I. .单酶切：II. 双酶切：注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。
灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。
二. 结果与分析：假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。
如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。
如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。
图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析M1 ：λ DNA/ HindIII M2：DL2000 1 - 6: 重组质粒HindIII XbaI重组质粒用HindIII XbaI双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和0.3kb。
双酶切连接反应的经验谈：双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1, 000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66= 0.106524μg。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
8、酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
9、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：1 0，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的D NA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是53 80bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。
10、连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
而它的浓度为3 50 U/μl ，所以完全够用。
连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。
时间3个小时足已。
11、双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。
如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。
第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。
厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。
有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。
12、第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收DNA片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用PCR产物回收试剂盒纯化酶切样保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。
还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管，将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ddH2O,离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升ddH2O在膜上，将柱子反转插入新的eppendorf管上，离心，即可将DNA片段离下来，做下一次酶切。
操作步骤1.反应体系的建立：⑴在一无菌1.5mlEppendorf管中加入：无菌双蒸水7μl10×酶切缓冲液2μl质粒DNA(100ng/μl)10μlEcoRⅠ(5U/μl)1μl总体积为20μl⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。
2.37℃水浴1h。
3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。
4.12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。
5.取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100V30～60min。
6结果观察。
操作注意事项：1.吸样量一定要准确2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3.要求在冰上操作，并充分混匀，4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。
5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。
限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。
3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。
酶切技术-技术问题1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是同一限制酶切割DNA粘性末端的连接柱式，优选柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
优选TAKARA的纯化柱试剂盒。
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×650）/1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。