实验3酶切与连接
实验三、酶切与连接
一、实验目的与原理简介
限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。
制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带；
而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面：
1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况；
4）切割与连接方式；5）接头状态。
酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种：
1）部分酶是指同一DNA 片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。
2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。
二、材料和试剂
限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪
三、实验步骤
1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下：
2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。
3）切胶回收（尽量不要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。
4）回收产物电泳检测后进行连接：
连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl
目的基因 6μl
质粒载体 2μl
产物酶切体系
pPI9K 质粒酶切体系 DDW
4.6μl DDW 7μl 10×H
Buffer
1μl 10×H Buffer 1μl 目的片段
4μl pPI9K 质粒 1.6μl NotI quickcut 0.2μl NotI quickcut 0.2μl
EcoRI quickcut 0.2μl(37℃15min) EcoRI quickcut
0.2μl(37
℃15min)
T4 Ligase 1μl
混合后16℃，过夜连接。完成后放入4℃冰箱可，备用。
四、注意事项
1、加样次序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶。
2、限制性内切酶的量不要过多，最多不超过部体积的1/10，否则易发生酶的星号反应。所谓酶的星号反应就是指改变酶切条件时酶的识别位点专一性下降，导致酶切图谱混乱的现象。
3、内切酶的选择和使用方案须根据具体的实验情况来精心设计。
4、限制性内切酶和连接酶都极易失活，须在冰盒上操作，同时防止污染。
2019届高考生物总复习：专题三_设计酶的相关实验_含答案
培优点三设计酶的相关实验 一、“对照实验法”设计酶的相关实验 应用1：“对比实验法”探究酶的催化作用 典例1.食虫植物是一种会捕获并消化动物的植物，为了验证其分泌液中有蛋白酶，某学生设计了两组实验，如图所示，在适宜温度的水浴中保温一段时间后，试管1、2中加入适量双缩脲试剂，试管3、4不加任何试剂，下列有关实验的叙述正确的是（） A．如果试管1中出现紫色反应，即能证明分泌液中有蛋白酶 B．实验②的观测指标能证明分泌液中有蛋白酶 C．由试管2、3构成的对照实验，即可得出实验结论 D．实验①是对照组、实验②为实验组，两组一起才能达到实验目的 【解析】试管1中蛋白液没有分解的话也会出现紫色反应，A错误；实验②中如果蛋白块变小的话，说明分泌物中含有蛋白酶，B正确；试管1和2形成对照，试管3和4形成对照，由四支试管构成的实验得出实验结论，C错误；试管1和2形成对照，试管3和4形成对照，实验①和实验②不符合单一变量原则，不能形成对照，D错误。 【答案】B 应用2：“对比实验法”探究酶的高效性 典例2. 对该实验的有关分析不正确的是（）
A．在上表的实验处理中，研究了温度和催化剂两个自变量 B．试管2中因为没有加入任何试剂，所以应为空白对照组 C．若试管4和试管1组成对照实验，可说明酶具有催化作用 D．若要研究酶的高效性，可选用的实验组合是试管4和试管3 【解析】根据表格信息，试管1和试管2的变量为温度，试管3和试管4的变量为催化剂种类，二者均是自变量，其他因素如反应物浓度、pH等为无关变量；试管2虽没有添加任何试剂，但是温度与试管1不同，因此也是实验组；试管1和试管4的不同点为是否添加了酶，由此可以证明酶具有催化作用；试管3和试管4的不同点是催化剂的种类、酶或无机催化剂，因此可以证明酶的高效性，综上所述，B正确。 【答案】B 应用3：“对比实验法”探究酶的专一性 典例3.某同学进行了下列有关酶的实验： 甲组：淀粉溶液+新鲜唾液→加入斐林试剂→出现砖红色沉淀 乙组：蔗糖溶液+新鲜唾液→加入斐林试剂→不出现砖红色沉淀 丙组：蔗糖溶液+蔗糖酶溶液→加入斐林试剂→？ 下列叙述正确的是（） A．丙组的实验结果是“不出现砖红色沉淀” B．三组实验都应该在37℃条件下进行 C．该同学的实验目的是验证酶的专一性 D．可用碘液代替斐林试剂进行检测 【解析】因为蔗糖被蔗糖酶催化水解生成葡萄糖和果糖，有还原性，加入斐林试剂出现砖红色沉淀，A错误；加入斐林试剂必须水浴加热至50~65℃，B错误；唾液淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖，蔗糖酶才能水解蔗糖，故该实验能验证酶的专一性，C正确；如用碘液代替斐林试剂，则三个组都不会出现蓝色，无法检测，D错误。 【答案】C 应用4：“梯度法”探究影响酶活性的因素（温度或pH） 典例4. 小张查阅资料得知，α-淀粉酶的最适温度是55 ℃。下表是他为此进行的验证实验，但因各组结果相同而不能达到实验目的。以下改进措施中可行的是( )
常用限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点 AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点
BbvCI识别位点BbvI识别位点 BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点
BsiEI 识别位点BsiHKAI 识别位点BsiWI识别位点BslI 识别位点BsmAI识别位点 BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点
19-20 第4章 素能提升课 酶的相关实验设计
[核心精要] 1．试剂检测法——鉴定酶的本质 (1)设计思路：从酶的化学本质上来讲，绝大多数酶是蛋白质，少数酶是RNA。在高中教材中常见的一些酶，如淀粉酶、蛋白酶等，其本质都是蛋白质，所以，对酶本质的鉴定常常是变相地考查蛋白质的鉴定方法。因此，利用双缩脲试剂可与蛋白质产生紫色反应的原理制订实验方案即可。 (2)设计方案 ①探究酶的本质是否为蛋白质 2．对比法——探究或验证酶的高效性、专一性及影响酶活性的因素 (1)验证酶的高效性 ①设计思路：验证酶高效性的方法是对比法，即通过对不同类型催化剂(主要是与无机催化剂进行比较)催化反应物的反应速率进行比较，得出结论。 ②设计方案
说明：实验中自变量是催化剂的种类(酶与无机催化剂)，因变量是反应物的反应速度。 (2)验证酶的专一性 ①设计思路：验证酶的专一性的方法也是对比法，常见的方案：反应物不同但酶相同，最后通过观察酶促反应能否进行而得出结论。 ②设计方案 ①设计思路：采取对比的手段，将待探究的环境因素施加到实验组上，将其与对照组比较，观察酶促反应速率的变化，就可确定该环境因素对酶活性的影响。 ②设计方案 (1)设计思路：常用“梯度法”来探究酶的最适温度(或pH)，设计实验时需
设置一系列不同温度(或pH)的实验组进行相互对照，最后根据实验现象得出结论。 (2)一般步骤 说明：探究酶最适温度(或pH)的实验过程中，应注意在反应物和酶混合之前，应让反应物和酶首先达到实验温度(或pH)，如果先混合再调整温度(或pH)，则在达到实验温度(或pH)之前，反应已经进行，实验结果不准确。探究酶催化作用的最适温度(pH)实验中，选择反应物和对应的酶时应注意温度(pH)本身是否会影响反应物的反应速率。如探究酶的最适温度时，不能选用H2O2作反应物，因为温度会影响H2O2的分解速率。 [对点练习] 1．瑞典研究人员发现一种促进脂肪细胞生成的蛋白质——抗酒石酸酸性磷酸酶。这一发现有望为治疗肥胖症开辟新途径。下列有关叙述不正确的是() A．抗酒石酸酸性磷酸酶与脂肪的共有元素有C、H、O B．在适宜条件下，蛋白酶可以将抗酒石酸酸性磷酸酶水解 C．抗酒石酸酸性磷酸酶遇双缩脲试剂呈现紫色 D．理论上可以通过促进抗酒石酸酸性磷酸酶的功能来治疗肥胖症 D[抗酒石酸酸性磷酸酶的本质是蛋白质，和脂肪共有的元素有C、H、O，A正确；在适宜条件下，该酶可被蛋白酶分解，可与双缩脲试剂发生紫色反应，B、C正确；抗酒石酸酸性磷酸酶能促进脂肪细胞生成，若促进其功能，则会使脂肪细胞增多，不能用来治疗肥胖症，D错误。]
限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点
BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点
BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点
双酶切实验
双酶切概述 双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“se q”标注。 [编辑本段] 双酶切的注意事项 1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。 2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。 3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照： 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。 [编辑本段] 双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：
限制性内切酶酶切位点_方便搜索
GACGTC CTGCAG Acc65I 识别位点 GTMKAC CAKMTG AccI 识别位点 GTMKAC CAKMTG AciI 识别位点 CCGC GGCG AclI 识别位点 AACGTT TTGCAA AcuI 识别位点 CTGAAG GACTTC AfeI 识别位点 AGCGCT TCGCGA CTTAAG GAATTC AflIII 识别位点 ACRYGT TGYRCA AgeI 识别位点 ACCGGT TGGCCA AhdI 识别位点 GACNNNNNGTC CTGNNNNNCAG AleI 识别位点 CACNNNNGTG GTGNNNNCAC AluI 识别位点 AGCT TCGA AlwI 识别位点 GGATC CCTAG
CAGNNNCTG GTCNNNGAC ApaI 识别位点 GGGCCC CCCGGG ApaLI 识别位点 GTGCAC CACGTG ApeKI 识别位点 GCWGC CGWCG ApoI 识别位点 RAATTY YTTAAR AscI 识别位点 GGCGCGCC CCGCGCGG AseI 识别位点 ATTAAT TAATTA GCGATCGC CGCTAGCG AvaI 识别位点 CYCGRG GRGCYC AvaII 识别位点 GGWCC CCWGG AvrII 识别位点 CCTAGG GGATCC BaeI 识别位点 NACNGTAYCN BamHI 识别位点 GGATCC CCTAGG BanI 识别位点 GGYRCC CCRYGG
常用限制性内切酶酶切位点
AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点
AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI 识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点 BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点
BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点
与酶相关的实验设计与分析
与酶相关的实验设计与分析 真题回放 (2016·全国卷Ⅰ)若除酶外所有试剂均已预保温，则在测定酶活力的实验中，下列操作顺序合理的是(C) A．加入酶→加入底物→加入缓冲液→保温并计时→一段时间后检测产物的量 B．加入底物→加入酶→计时→加入缓冲液→保温→一段时间后检测产物的量 C．加入缓冲液→加入底物→加入酶→保温并计时→一段时间后检测产物的量 D．加入底物→计时→加入酶→加入缓冲液→保温→一段时间后检测产物的量 [解析]根据题意可知，该实验的pH为无关变量，为了排除pH的干扰，应在酶和底物混合之前加入缓冲液，为酶促反应提供稳定的pH环境，A、B、D项都错误，C项正确。 核心拓展 1．辨清与酶相关实验设计的五个易错点(填空) (1)若底物选择淀粉和蔗糖，酶溶液为淀粉酶，验证酶的专一性，检测底物是否被分解的试剂宜选用斐林试剂，而不能选用碘液，是因为_碘液无法检测蔗糖是否被水解__。 (2)探究酶的适宜温度时： ①不宜选用过氧化氢酶催化H2O2分解，因为_H2O2受热易分解__。 ②若选淀粉和淀粉酶，检测试剂不应选用斐林试剂，因为_斐林试剂需要水浴加热__，而本实验需严格控制温度。 (3)在酶的最适pH探究实验中，操作时必须先将酶和底物分别置于不同pH条件下，然后再将同一pH条件下处理的底物和酶混合，而不能把酶加入反应物中后，再加入盐酸或氢氧化钠。 (4)探究酶的高效性时，对照组应_加入无机催化剂__；探究酶的催化作用时，对照组应_不加催化剂__。 2．掌握两类实验设计 (1)验证酶的本质、作用特性的实验设计： 实验目的实验组对照组实验组衡量标准 验证某种酶是蛋白质待测酶液＋双缩 脲试剂 已知蛋白液＋双缩脲试剂是否出现_紫色__ 验证酶具有催化作用底物＋相应酶液底物＋_等量蒸馏水__ 底物是否被分解 验证酶的专一性底物＋相应酶液另一底物＋_相同酶液__或 同一底物＋另一酶液 底物是否被分解 验证酶具有高效性底物＋相应酶液底物＋_等量无机催化剂__ 底物分解速率或
常用限制性内切酶酶切位点保护残基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
质粒DNA的制备和酶切
实验十五质粒DNA的制备和酶切 一、实验目的及背景 质粒时细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名为质粒。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极为广泛的应用价值。本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的如碱变性法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石栏层析法等。各个方法分离是依据宿主菌株类型，质粒分子大小，碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且得率较高，获得的质粒可以用于酶切，连接与转化。 碱变性法基本原理是，在pH为12.0-12.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA 和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可去除大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 在获得较纯的质粒后，我们常常会利用核酸限制性内切酶对质粒进行酶切，就可以达到在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造。核酸限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，能够以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为I/II/III型三大类，II型酶就是通常指的DNA限制性内切酶，他们能识别双链DNA的特异序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。II型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别序列一般为4~6个碱基对的反转重复序列，可以切割DNA 产生三种不同的切口：①5’端突出②3’端突出③平末端。在酶切反应中应当注意以下几个问题：内切酶的纯度和用量、内切酶底物（DNA）的纯度和浓度、反应缓冲液、酶解温度与时间。 二、实验试剂 1.LB培养基：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，定容至1L，调节 pH至7.5 2.STE溶液：0.1M NaCl、10mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA 3.Amp抗生素：50mg/ml 4.溶菌酶：10mg/ml（用10mM Tris- HCl pH8.0新鲜配制） 5.溶液I：50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM EDTA 6.溶液II（新鲜配制）：0.2M NaOH、1% SDS
质粒DNA及λDNA的酶切分子生物学实验
质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定 一、实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 二、实验原理: 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源DNA分子连接连接连接连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养，可以通过αααα互补筛选法互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切酶切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及PCRPCRPCRPCR检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴定。 1.重组子的构建 酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。） 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5'-磷酸和3'-OH间形成磷酸二酯键。它可以连接酶，T4DNA噬菌体的T4连接酶是来自DNA在分子克隆中最有用的．
酶切反应条件的优化
当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，加入适量的DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。根据定义，在50μl体系中，1单位的限制性内切酶可以在60分钟内完全切割1μg的底物DNA。上述酶、DNA与总反应体积的比值可以做为建立反应体系的参考数据。但是，目前大多数科研人员会遵循下表中所列的标准反应条件，使用5－10倍的过量酶切割DNA，这样有利于克服由于DNA来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败。 “标准”反应体系 内切酶 ?从冰箱取出后请一直置于冰上。 ?酶最后加入到反应体系中。 ?加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。切忌振荡混匀！ ?当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋DNA时，通常需要超过1unit/μg的酶量以达到完全酶切。DNA ?避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。 ?甲基化的DNA会抑制某些酶的切割效率。 缓冲液 ?使用终浓度为1X的缓冲液。 ?根据实验需要加入终浓度为100μg/ml的BSA（1:100稀释）。 ?在不需要BSA即可达到最佳活性的酶切反应中如果加入BSA也不会影响酶切效果。 反应总体积 ?建议在50μl反应体系中消化1μg底物DNA。 ?为避免星号活性，甘油浓度应<5%。 ?加入内切酶（贮存于50%甘油中）的量应不超过总体积的10%。 ?使用以下技术，内切酶的反应条件可能未达到最佳反应条件：克隆、基因分型、突变检测、基因定位、探针制备、测序和甲基化检测等。 ?内切酶贮存液中的添加物（如：甘油和盐）和底物溶液中尚存的残余物（如：盐、EDTA 或乙醇）会导致小体积反应体系出现问题。NEB提供了一系列高保真内切酶（方便建立反应体系。下述为小体积反应体系反应指南。 酶切反应体系的选择
限制性内切酶保护碱基表
PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表
ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3'
探究温度对酶活性影响的实验设计
探究温度对酶活性影响的实验设计 遵义县团溪中学黄定梅 “新陈代谢与酶”是高中生物学的一个重要内容，学生必须通过实验探究酶的活性及 其特征，为此，我先后尝试用唾液淀粉酶催化淀粉水解，过氧化氢酶催化H 2O 2 分解来研究 温度和PH值对酶活性的影响，但实验效果不佳，于是我对此实验作了改进，取得了良好的实验效果，其具体实验方案如下： 一、实验目的 1、学会探索影响酶活性因素的方法。 2、探索a—淀粉酶不同温度下催化淀粉水解的情况。 二、实验原理 淀粉遇碘后，形成蓝紫色复合物，a—淀粉酶可以催化淀粉逐步水解成麦芽糖和葡萄糖，麦芽糖和葡萄糖遇碘后不显色。 三、实验材料和用具 试管12支，试管刷1把，试管架1个，刻度吸管2支，恒温水浴箱2台（水温分别保持在60℃、100℃）、塑料烧杯1个（冻冰），铅笔1支，1%淀粉溶液，%a—淀粉酶溶液，卢戈氏碘液，蒸馏水。 四、实验准备 1、实验前教师应配制好1%淀粉溶液和%的a—淀粉酶溶液，卢戈氏碘液。 2、课前90min，打开2个温水浴箱，并调好温度。 五、实验步骤和实验记录 温度对淀粉酶活性的影响
六、实验结论： 在不同温度下，a-淀粉酶的活性不同，低于最适温度，a-淀粉酶的活性没有全部释放，高于最适温度a-淀粉酶的活性随着温度的升高而消失。从以上实验表格可知，在2℃时，a-淀粉酶的活性最低，几乎没有活性，在60℃时，a-淀粉酶的活性最高，即60℃为最适温度，在96℃时，a-淀粉酶活性完全丧失。 七、说明： 1）对照组均为深蓝色，实验组中冰水组颜色为深棕色，60℃时为黄色，100℃时为深蓝色。 2）水浴箱水温100℃时，敞开盖后只能维持96℃。所以测定的是96℃下酶的活性，但也可以观察到明显现象。 3）水浴锅要保持水温60℃时，应设定在61℃，敞开盖时的实际温度为60.1℃左右。
2020年高考生物提分策略题型02 与酶相关的实验分析与设计(含答案解析).doc
题型02 与酶相关的实验分析与设计 1．探究酶的化学本质 2．验证酶的专一性 （1）设计思路：酶相同，底物不同(或底物相同，酶不同)。 （2）设计方案示例 （3）结论：淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化蔗糖水解，酶具有专一性。 3．验证酶的高效性 （1）设计思路：将用酶催化的反应与用无机催化剂催化的反应进行对照，即酶的催化效率比无机催化剂高。 （2）设计方案示例 4．探究酶的最适温度或最适pH （1）实验设计思路 ?????底物＋T 1pH 1＋酶液 底物＋T 2pH 2＋酶液底物＋T 3pH 3＋酶液 ? ? ?底物＋T n pH n ＋酶液底物的分解速率或存在量 （2）操作步骤
易错警示 （1）不能用过氧化氢酶来探究温度对酶活性的影响，因为加热本身也能使过氧化氢分解加快。 （2）必须在达到预设的温度条件后，再让反应物与酶接触，避免在未达到预设的温度时反应物与酶接触发生反应，影响实验结果。 （3）在探究温度对淀粉酶活性影响的实验时，最好不用斐林试剂来检测淀粉是否在淀粉酶的催化下水解生成麦芽糖等还原糖，因为加入斐林试剂后需要水浴加热才能出现砖红色沉淀，这样原处于低温条件下的淀粉酶的活性会慢慢恢复，催化淀粉水解产生还原糖，导致形成错觉，从而得出错误的结论。 （4）用不同底物、同种酶来探究酶的专一性时，若是用淀粉酶作用于淀粉、蔗糖两种底物，则应用斐林试剂作为检测试剂，不能选用碘液作为检测试剂，因为碘液无法检测蔗糖是否发生了水解。 一、选择题 1．下列有关酶的实验设计思路，正确的是 A．利用过氧化氢和过氧化氢酶研究温度对酶活性的影响 B．利用淀粉、蔗糖、淀粉酶和碘液验证酶的专一性 C．利用过氧化氢、新鲜的猪肝研磨液和氯化铁溶液研究酶的高效性 D．利用胃蛋白酶、蛋清和pH分别为3、7、11的缓冲液验证pH对酶活性的影响 【答案】C 【解析】因为过氧化氢不稳定，在高温下会自行分解成水和氧气，从而不能正确表现温度对酶活性的影响；利用淀粉、蔗糖、淀粉酶验证酶的专一性，只能用斐林试剂鉴定，根据是否有砖红色沉淀来判断淀粉酶是否对二者都有催化作用，从而探究酶的专一性，不能用碘液，因为碘液无法检测蔗糖是否被分解； 胃蛋白酶的最适pH为1．5，验证pH对酶活性的影响应设置在最适pH左右。 2．如图所示，某一化学反应进行到t1时，加入一定量的酶，该反应在最适条件下进行直到终止。以下叙述错误的是 A．该实验体现酶的高效性
史上最全限制性内切酶酶切位点汇总
A系列 AatII识别位点 Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点
BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点
BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点
ppinkHC限制性酶切位点
pPink-HC bp 7667 Restriction Map Enzyme # of cuts Positions AatI 1965 AatII 17202 Acc65I 1971 4836 AccI 22759 3871 AccIII 2946 AciI 46321 657 1066 1277 1279(c) 1283 1361 1870(c) 2630 2837 3190(c) 4721(c) 5077 5180 5236(c) 5246(c) 5270 5313(c) 5320(c) 5341(c) 5432 5460 5587 5606 5727 5837(c) 5972 5981(c) 6343 6434 6625(c) 6671 6792(c) 6836 6913 7022 7121(c) 7168 7342(c) 7381(c) 7391(c) 7417(c) 7455(c) 7468 7494 7551(c) AcsI 6747 942 1167 2990 3080 5002 AcyI 36817 7199 7503 AflII 14777 AflIII 61192 2169 3030 4269 4766 5387 AluI 32207 318 798 838 875 1270 1338 1486 1999 2011 2467 3285 3568 3881 3980 4144 4181 5030 5052 5147 5211 5329 5555 5645 5691 5948 6469 6569 6632 7311 7330 7575 Alw44I 5623 1930 5701 6947 7444 AlwI 141268(c) 1281 1458 2394 4620(c) 4881(c) 5948(c) 6034(c) 6036 6132(c) 6133 6596(c) 6913 6917(c) AlwNI 42041 2509 2665 5803 AosI 31433 6502 7525 ApaLI 5623 1930 5701 6947 7444
质粒提取与酶切电泳实验报告
Preparation of Plasmid DNA, Restriction Enzyme Digestion, and Agarose Gel Electrophoresis 2014/10/14-21 1 Intro 1.1 Objective To learn ?The characteristics of plasmid DNA ?The method of plasmid DNA mini-preparation by alkaline lysis and the measurement of DNA concentration by spectrophotometer ?The characteristics of restriction endonuclease ?How to use agarose gel electrophoresis to separate DNAs To understand: The principles of purification and quantification of plasmid DNA 1.2 Principle 1.2.1 Plasmid and Vector Plasmid is a small, independently replicating, piece of extrachromosomal cytoplasmic DNA( double stranded and usually circular ) that is capable of autonomous replication and can be transferred from one organism to another. Vector serve as carriers to allow replication of recombinant DNA in the host cell, usually a vector covers ?Antibiotic resistance gene: such as ampicillin resistant gene, kanamycine resistant gene, and etc. ?Origin of replication (ori ). ?Multiple cloning site (MSC) or polylinker ?Marker genes: such as LacZ gene. 1.2.2 Alkaline Lysis ( 0.2molNaOH + 1%SDS ) SDS is a kind of anionic detergent. It can break bacterial cells and denature proteins. When bacterial cell wall is broken, the plasmid DNA and genomic DNA will be released out and be denatured in alkali environment. When the solution is neutralized by acidic reagent (such as KAc) , the plasmid DNA will be renatured rapidly due to its smaller size. After centrifugation, the plasmid DNA will be in supernatant, while the genomic DNA will stay in the sediment at the bottom of the tubes together with other cell debris. 1.2.3 DNA Concentration Measurement Based on the strong absorbance of base pairs (A-T, G-C) at 260nm UV, the concentration of DNA can be measured by spectrophotometry. When detected under neutral condition, A260 is used to calculate the nucleic acid concentration where as the ratio of A260/A280 can be used to estimate the purity of nucleic acid (1.8 for pure DNA). 1.2.4 Restriction Endonuclease TypeII RE cuts dsDNA at specific restriction sites on specific sequence, producing restriction fragments. 1.2.5 Gel Electrophoresis