实验 质粒DNA的酶切
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
质粒DNA的提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
质粒酶切反应实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握质粒DNA的提取方法。
2. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和操作方法。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定质粒DNA的酶切位点。
二、实验原理质粒DNA是细菌染色体外的DNA分子，常用于基因克隆和分子生物学研究。
限制性核酸内切酶（RE）是一种可以识别并切割特定DNA序列的酶，常用于分子生物学实验中。
本实验通过提取质粒DNA，利用限制性核酸内切酶进行酶切反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，以鉴定质粒DNA的酶切位点。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌株（含有目的质粒）、限制性核酸内切酶、琼脂糖、DNA 分子量标准、TAE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR仪等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、异丙醇、70%乙醇等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取（1）取适量大肠杆菌菌株，加入适量无菌水，用玻璃棒轻轻搅拌，制成菌悬液。
（2）向菌悬液中加入适量的Tris-HCl缓冲液、EDTA和蛋白酶K，充分混匀。
（3）将菌悬液放入65℃水浴中，孵育30分钟。
（4）向菌悬液中加入适量的SDS和酚/氯仿，充分混匀。
（5）12,000 r/min离心10分钟，取上清液。
（6）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置2小时。
（7）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（8）向沉淀中加入70%乙醇，混匀，室温静置5分钟。
（9）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（10）将沉淀溶于适量的无菌水中，即为质粒DNA。
2. 酶切反应（1）取适量的质粒DNA，加入适量的限制性核酸内切酶，混匀。
（2）将混合液置于37℃水浴中，孵育适当时间。
（3）酶切反应结束后，加入适量的EDTA，终止反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA分子量标准。
（2）将酶切反应产物加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。
质粒DNA的酶切和PCR
发现使PCR技术能够广泛地应用于各个相关
领域。
• 平常放负20℃保存，用时候放在冰上。
质粒DNA的酶切实验步骤
• 酶切体系(20ul)
DNA（质粒） 8.0 ul
10×Buffer 2.1 2.0 ul
EcoRI
0.5 ul
BamHI
0.5 ul
ddH2O
9.0 ul
20ul 5 ul × 10 体系 5 ul 90ul
实验说明
• EcoRⅠ是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一 个限制酶,酶切序列为 ,形成黏性末端。
• BamHⅠ由淀粉芽孢杆菌产生,它也是一种限
制酶，酶切序列为5' G^GATCC 3‘ 3' CCTAG^G5'
,
形成黏性末端。
• Taq酶即DNA聚合酶，是来源于高温嗜热菌，
其最大的特点就是高温下不失活，Taq酶的
每管12.0 ul分装
加完体系后，将离心管放入水浴锅37℃， 3h左右即可。
PCR体系和程序
PCR体系（20ul）
DNA（质粒）
1.0 ul
ddH2O 引物（M13 F） 引物（M13 R）
dNTP 10×PCR Buffer Mg2+（MgCl2） Taq酶 (最后加)
14.0 ul 0.5 ul 0.5 ul
实验二：质粒DNA的酶切和PCR
2015.11.10
• 1 酶切原理 • 2 PCR原理 • 3 实验说明 • 4 注意事项
酶切原理
质粒DNA
酶切
PCR原理
• 聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction，简 称PCR）。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分 子生物学技术，可看作生物体外的特殊DNA复制，PCR的 最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
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加样顺序：水+缓冲液+DNA+酶
影响限制性内切酶的因素： DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、 乙醇、EDTA、SDS) 解决办法： 增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂 增加酶作用单位 延长反应时间
酶的星号活性:
改变酶切条件时酶的识别位点专一性 下降的现象
部分酶切和完全酶切 酶的保存
思考题
对核酸进行限制性酶切时应注意什么？ 如何提高核酸电泳的分辨率？ EB染色的特点和注意事项是什么?
计算举例:
48502 /Marker DNA总量=同 等亮度条带的bp数/待测样品 的DNA量(ng)
不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性 DNA分子的有效范围
琼脂糖浓度/%
0.3 0.6
电泳
注意:务必记录点样顺序和点样量
接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正 负极) 恒压100V, 电泳40-60分钟 紫外灯下观察并记录结果 分析结果并鉴定样品纯度
大量酶切
无菌ddH2O
5xbuffer H (BSA) 质粒DNA EcoRI
43 uL
16 uL 16 uL 5 uL 总体积 80 uL
影响泳动速率的因素
电场强度
DNA在电泳条件下带负电荷，在电场作用下向正极泳 动
分子量大小与DNA构型
质粒三种构型的泳动速率：超螺旋 线型 开环
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
凝胶浓度 电泳缓冲液： TAE TBE（大于实际分子量） TPE
分子量标准
定义: 在电泳测定DNA样
品的分子量及浓度的 过 程中所使用的标准样品对 照.
分离范围/kb
5 - 60 1 - 20
0.7
0.9 1.2 1.5 2.0
0.8 - 10
0.5 - 7 0.4 - 6 0.2 - 3 0.1 - 2
实验材料
50xTAE buffer
6xLoading buffer（溴酚蓝+蔗糖） 琼脂糖 溴化乙锭, goldviewna DNA marker（DNA HindIII/EcoRI）
质粒DNA
EcoRI及其BufferH
实验仪器
琼脂糖凝胶电泳系统 电泳仪，电泳槽，制胶板、梳子
Restriction enzyme name, recognition sequence
Hind III RI
A|AGCTT CTGCA | G TTCGA | A G | ACGTC
Bam HI Pst I
G|GATCC CCTAG|G G | AATTC
Eco
CTTAA | G
Sticky end or
台式离心机
紫外透射仪
实验步骤
一、制胶 将制胶槽及梳子放入制胶模具 称取0.2g琼脂糖于三角瓶中, 加入20mL1xTAE , 加热至无颗粒状琼脂糖 冷却至65C加入goldviewna(0.5ug/mL) 2.0uL 摇匀,倒入制胶槽中待凝固 拔取梳子放入电泳槽中备用 倒入适量(80mL) 1xTAE buffer
星活性
限制性内切酶识别特异性放宽。
EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但 如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松 动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别 能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位 点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子 强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚 枫，二价阳离子，12%乙醇。
实验 质粒DNA的酶切
小量酶切:
无菌ddH2O 5xbuffer H (BSA) 质粒DNA EcoRI 总体积 13μL 4 μL 2 μL 1 μL 20 uL
混匀后,离心， 37°C酶切60分钟。
限制性内切酶
类型
I型 II型
III型
特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的特 殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在 此切割双链DNA。 多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸， 呈二元对称，少数识别更长的序列， 有的切割后形成平端，有的形成粘端。
cohesive end Eco RV
GAT | ATC
Blunt end
限制性内切酶
已经发现和鉴定了200多种 EcoRI 特 异 识 别 GAATTC及其互 补碱基组成的双 链片段 粘性末端 T4连接酶
酶单位定义：
酶反应条件：
缓冲体系（多酶切原则） 酶切温度 反应时间 DNA的
样品准备
质粒
1uL质粒 + 1uL Loading buffer 混匀
酶切样品
10 uL DNA/EcoRI+2 uL Loading buffer
DNA marker
5uL DSTM 5000 (- HindIII/EcoRI)
加样
每2人一块胶 每人上2个样品（质粒原液、酶切样 品） 每块胶一个Marker（5μL）
实验四
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
背景知识介绍
DNA的电泳分离技术是基因工程中的一项
最基本技术。
特点：快速、简便、样品用量少、灵敏度 高以及一次测定中可获多种信息
琼脂糖凝胶电泳
DNA、 RNA检测和分离的重要手段。 其分离是根据分子大小与构型形成的分 子筛效应
适于分离200bp-50Kb的DNA片段
[实验原理]
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场 中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应 和分子筛效应。 在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于 分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动 速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
常用类型:
-HindIII, HindIII/EcoRI, PCR marker
选用的原则:
构型与被测分子相同 标准片段分子能包含被测分子 某些分子量标准使用前需要进 行预处理
-HindIII
-HindIII/EcoRI
[目的要求] 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度
的原理；
了解电泳过程中各因素对测定结果的影响； 掌握制胶、电泳、浓度测定的基本分析技术 。