实验六-酶切
本科生六个基本生物学实验
实验一：感受态细胞的制备1.原理：当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。
转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。
一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。
然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。
这一方法是分子生物学常用实验方法。
2.实验材料2.1LB液体培养基2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。
2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）；移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱3.操作方法3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。
次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。
3.2自该步骤起皆需无菌操作。
在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。
3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。
3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。
3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。
3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。
3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒酶切反应实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握质粒DNA的提取方法。
2. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和操作方法。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定质粒DNA的酶切位点。
二、实验原理质粒DNA是细菌染色体外的DNA分子，常用于基因克隆和分子生物学研究。
限制性核酸内切酶（RE）是一种可以识别并切割特定DNA序列的酶，常用于分子生物学实验中。
本实验通过提取质粒DNA，利用限制性核酸内切酶进行酶切反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，以鉴定质粒DNA的酶切位点。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌株（含有目的质粒）、限制性核酸内切酶、琼脂糖、DNA 分子量标准、TAE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR仪等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、异丙醇、70%乙醇等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取（1）取适量大肠杆菌菌株，加入适量无菌水，用玻璃棒轻轻搅拌，制成菌悬液。
（2）向菌悬液中加入适量的Tris-HCl缓冲液、EDTA和蛋白酶K，充分混匀。
（3）将菌悬液放入65℃水浴中，孵育30分钟。
（4）向菌悬液中加入适量的SDS和酚/氯仿，充分混匀。
（5）12,000 r/min离心10分钟，取上清液。
（6）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置2小时。
（7）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（8）向沉淀中加入70%乙醇，混匀，室温静置5分钟。
（9）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（10）将沉淀溶于适量的无菌水中，即为质粒DNA。
2. 酶切反应（1）取适量的质粒DNA，加入适量的限制性核酸内切酶，混匀。
（2）将混合液置于37℃水浴中，孵育适当时间。
（3）酶切反应结束后，加入适量的EDTA，终止反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA分子量标准。
（2）将酶切反应产物加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。
实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂， 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。 121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中
pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码 信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主 细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶 （ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物XGal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如 用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重 组质粒的细菌形成白色菌落。
4000rpm离心5分钟。
2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分）。
3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。
切fc标签的酶切位点
切fc标签的酶切位点1.引言1.1 概述概述部分的内容可以围绕以下几个方面展开：酶切位点是指在DNA或RNA分子中，由特定的酶所识别并切割的特定序列。
在分子生物学研究中，酶切位点起着至关重要的作用，能够帮助科学家们进行基因工程，提供了许多重要的实验手段。
酶切位点的作用主要有两个方面。
首先，酶切位点可以用于在DNA或RNA分子中特定的位置进行切割，从而产生特定的断裂端。
这种切割作用可以用于插入或删除特定的DNA或RNA片段，为进行基因工程提供了便利。
其次，酶切位点还可以用于识别和验证目标分子的存在。
通过在特定的酶切位点上进行酶切反应，可以判断目标分子是否具有所需的序列。
这种酶切位点的验证方法被广泛应用于基因测序、基因突变分析等研究领域。
在切fc标签的酶切位点中，"fc"是指结合蛋白A或蛋白G的抗体Fc 区域，在蛋白质表达和纯化中起到了重要的作用。
通过选择合适的酶切位点，可以方便地将fc标签与目标蛋白连接起来或切割开来，实现对目标蛋白的定位和纯化。
目前，常用的切fc标签的酶切位点主要包括六个，分别是TEV (tobacco etch virus) 蛋白酶切割位点，HRV 3C (human rhinovirus) 蛋白酶切割位点，Factor Xa (FXa) 蛋白酶切割位点，Enterokinase (EK) 肠激酶切割位点，Thrombin (Thr) 血凝酶切割位点，和MCP (mousecarboxypepti-dase) 鼠卡糖肽酶切割位点。
以上是关于切fc标签的酶切位点的概述部分的内容。
接下来文章将进一步介绍这些酶切位点的定义和作用，并探讨它们在实验研究中的应用。
文章结构部分的内容应该包括本文的章节划分和每个章节的主要内容概述。
具体可以编写如下内容：文章结构：本文按照以下章节进行展开：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 酶切位点的定义和作用2.2 常用的切fc标签的酶切位点3. 结论3.1 总结3.2 展望下面将对每个章节的主要内容进行概述：1. 引言：引言部分将对本文的研究背景和意义进行概述，并介绍酶切位点在分子生物学研究中的重要性。
酶切注意事项及问题
1、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。
DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。
关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。
使用时的缓冲液浓度应为1X。
有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。
酶切鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。
根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。
其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。
然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。
三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。
2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。
4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。
若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。
酶切注意事项及问题
一、建立一个标准得酶切反应ﻫ目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位得内切酶可以切割1μg不同来源与纯度得DNA。
通常,一个５0μｌ得反应体系中,１μｌ得酶在1X NEＢｕffer终浓度及相应温度条件下反应１小时即可降解1μｇ已纯化好得DNA。
如果加入更多得酶,则可相应缩短反应时间;如果减少酶得用量,对许多酶来说,相应延长反应时间(不超过1６小时)也可完全反应。
ﻫﻫ二、选择正确得酶不言而喻，选择得酶在底物DＮＡ上必须至少有一个相应得识别位点。
识别碱基数目少得酶比碱基数目多得酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量5０%得DＮA链,一个识别4个碱基得酶将平均在每4４(256）个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基得酶将平均在每46(40９6)碱基切割一次。
内切酶得产物可以就是粘端得(3’或5’突出端),也可以就是平端得片段。
粘端产物可以与相容得其它内切酶产物连接，而所有得平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录得pａtible Cohesivｅ Eｎdｓ And Reｃｌｅaｖa ｂle Ｂｌunt Eｎｄs一文。
ﻫ三、酶ﻫ内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当就是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有得其它反应物都应当已经加好并已预混合)。
酶得用量视在底物上得切割频率而定。
例如,超螺旋与包埋法切割得DNＡ通常需要超过1U/μｇ得酶才能被完全切割。
参见目录第244与２64之"切割质粒DNA"与＂包埋法切割DNA"。
ﻫ四、ＤNA待切割得ＤＮA应当已去除酚、氯仿、乙醇、ＥDTA、去污剂或过多盐离子得污染,以免干扰酶得活性。
DＮA得甲基化也应该就是酶切要考虑到得因素。
关于甲基化得内容，参见第252页至25３页之甲基化相关内容。
五、缓冲液对于每一种酶ＮEB都提供相应得最佳缓冲液,可保证几乎１00％得酶活性。
使用时得缓冲液浓度应为1X。
有得酶要求１0０μg/mｌ得BSA以实现最佳活性。
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五、利用限制性内切酶克隆
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设
计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同 酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸 露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加 上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对 其识别位点进行有效切断。 酶切位点（内切酶的识别序列）要加在引物的 5‘端 具体为：5'-保护碱基+酶切位点+引物序列-3'
四、使用限制酶注意事项
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进
一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各 自的最适盐浓度。 若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先 使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。 也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后臵-70℃低温 冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶 切反应。
割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。
第二类内切酶
酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸
识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴
同尾酶；切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的 一类限制性内切酶。
这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相
同的粘性末端。 由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补 作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限 制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在， 不能被原来的限制性内切酶所识别。
双酶切
同步双酶切 分步酶切
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶
切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要 求，然后加入第二种酶完成双酶切反应
操作注意事项
1.吸样量一定要准确
2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶
3.要求在冰上操作，并充分混匀，
4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防 污染。
二、限制性内切酶类型
第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附
近的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的 核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 的固定位臵上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别 和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸 顺序的DNA片段。 第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文 顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位臵上切
同裂酶；有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷
酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可 能不同，识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶， 识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。
三、酶切效率影响因素
DNA纯度
缓冲液性内切酶不受RNA或单链DNA的影响
5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进 入管内造成实验失败。
限制性内切酶酶解中常见的问题 和原因
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失
活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限 制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不 存在该酶的识别顺序。 2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正 确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部 分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。 3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力； ②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它 DNA。
失活以终止反应。
4、12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。 5、取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖 6、结果观察
凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约 100V30 ～ 60min 。
酶切反应体系(50μl)
模板DNA：5μl 限制性内切酶10×Buffer：10μl (2×) 酶：各0.5 μl 去离子水：34 μl
不完全酶切
2000bp 1000bp 750bp
完全酶切
2000bp 1000bp 750bp 500bp
Marker-PUM 2686bp 2050bp 1507bp
周二
1119bp
878bp 500bp
周三
周三
周五
2692bp+800bp=3492bp 3492bp*0.7=2444bp
周五
目标片段
2000bp 1000bp 750bp 500bp
酶切验证
23.1kb 9.4kb 6.5kb 4.3kb 2.3kb 2.0kb 2692bp
实验六、酶切
一、限制性内切酶酶切实验原理
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一
种内切核酸酶。一般是在原核生物中发现，它可 以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入，但对自己的 DNA却无损害作用。由于这 种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制 性内切酶。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，在DNA片段的5’端为P，3’端为OH。
pMD®18-T Vector的结构
酶切技术
重组质粒DNA插入片段800bp 本实验所用限制性核酸内切酶为BamH I和Hind
III
磷酸二脂键断裂
酶切反应步骤
1、酶切体系的配备
在一无菌1.5ml Eppendorf管中加入 轻轻混匀，12000rpm离心5sec。
2、37℃水浴1h。 3 、将 Eppendorf 管臵 65℃ 水浴中 10min ，通过加热使酶