质粒的酶切、连接、与转化
主要包括酶切、连接和转化三个步骤。
主要包括酶切、连接和转化三个步骤。
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car质粒构建的原理
car质粒构建的原理车质粒构建的原理车质粒构建是一种常用的分子生物学技术，用于将感兴趣的基因片段插入到质粒中，以便在细胞中表达该基因。
质粒是一种环状的DNA分子，常见于细菌中，可以独立于细菌的染色体存在。
在车质粒构建中，质粒通常被用作载体，将目标基因片段插入质粒的多克隆位点中，然后将质粒转化到细菌中进行扩增和表达。
车质粒构建的原理可以分为以下几个步骤：1. 选择适当的质粒载体：质粒载体的选择应根据实验的需求而定。
一般而言，质粒载体应具有适当的多克隆位点，能够容纳目标基因的大小，并且能够在目标细胞中稳定复制和表达。
2. 准备目标基因片段：目标基因片段可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割或合成的方式获得。
在PCR扩增时，需要设计引物，使其能够特异性地扩增目标基因片段。
在限制性内切酶切割时，需要选择适当的酶切位点，使其能够切割目标基因的两侧，以便将其插入到质粒的多克隆位点中。
3. 酶切与连接：将目标基因片段与质粒载体进行酶切，以生成互补的粘性末端。
然后，将目标基因片段与质粒进行连接。
连接过程中，需要使用DNA连接酶来催化连接反应。
连接完成后，将得到的重组质粒转化到适当的宿主细胞中。
4. 转化与筛选：将重组质粒转化到细菌中，使其能够在细菌中复制和表达。
转化的方法可以是热激转化、电穿孔法或化学法等。
转化后，将转化细菌分散于含有抗生素的琼脂平板上，以筛选带有目标基因的细菌克隆。
抗生素通常与质粒上的抗生素抗性基因关联，只有带有重组质粒的细菌能够在抗生素的选择压下生长。
5. 验证重组质粒：通过PCR、酶切、测序等方法验证重组质粒中是否成功插入了目标基因。
这些验证方法可以确保质粒中的目标基因完整、准确，并且能够被正常地表达。
总结起来，车质粒构建是一种将目标基因片段插入质粒载体中的技术。
通过选择适当的质粒载体、准备目标基因片段、酶切与连接、转化与筛选以及验证重组质粒，可以获得带有目标基因的质粒，用于进一步的表达和功能研究。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
质粒重组的注意事项
质粒重组的注意事项1质粒重组主要包括质粒提取、限制性酶切、目的片段回收、连接及连接产物的转化这五个基本步骤。
现在结合本人在实验室长期从事质粒重组的实际情况总结一下质粒重组实验操作的一些注意事项。
1.1 质粒提取：质粒重组对质粒的质量要求比较高；我们实验室是用碱裂解法提取质粒，一般说来，如果质粒的拷贝数比较高而小量制备的质粒量可以满足实验需要的话，那么对于初学者本人不推荐在质粒提取这一步使用大量制备方法，因为大量制备方法步骤过多对质粒的“伤害”要大于小量提取方法且所需时间相对较长。
小量提取质粒过程中建议只用酚－氯仿抽提一次即可，上清少取一些（200ul一般）就不需要用氯仿再抽提一次了，最后在用TER 溶解质粒之前质粒的晾干最好是放在37度培养箱内，若质粒提取起始菌液为1.5ml则晾干时间最好不要超过10分钟（一般5分钟即可）；若质粒提取起始菌液为3ml则晾干时间最好不要超过20分钟，质粒晾干后马上加入TER 于60度水浴锅中助溶20分钟。
1.2 限制性酶切：一般我喜欢用总体积为80ul的酶切体系，加入的酶量为1ul（10个单位）。
对于将来要做为载体的DNA模板一般切割量是2－3ug；而对于做为外插片段的质粒则要考虑酶切下来的小片段与质粒的长度比例来确定模板量，比如我们要从10Kb的质粒上切下的外插片段长度为1Kb，那么我们的小片段与质粒的质量比为1：10，这样的话我们为了保证小片段有800ng－1ug而需要酶切的模板量则是8ug－10ug。
1.3 目的片段回收：酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯照射下切取所要的目的条带时，一定要谨记两个要求：1、一定要快；2、胶块一定要小。
1.4 连接：载体一般加50－100ng左右，外插片段加的量是保证与载体的mol比为3：1即可。
本人做连接反应从来不做梯度，因为我坚信如果回收的目的片段质量好的话，一个反应即可成功。
1.5 连接产物的转化：将连接产物转入大肠杆菌常用的方法有电转化法和热激法。
质粒DNA及λDNA的酶切分子生物学实验
质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法二、实验原理:外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术,这样重新组合的DNA分子叫做重组子;重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源DNA分子连接连接连接连接起来;将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中,将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养,可以通过αααα互补筛选法互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子,并可通过酶切酶切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及PCRPCRPCRPCR检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴定;1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱,选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点,否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA 时不能得到完整的目的基因;其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子;常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种;本实验采用单酶切法,即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段,酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端,再选用同样的限制性内切酶处理载体;在构建重组子时,除了形成正常的重组子外,还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中,或目的DNA串联后再插入载体分子中,甚至出现载体分子自连,重新环化的现象;单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂;各种限制性内切酶都有去最佳反应条件,最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成,在双酶切体系中,限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐,先低温后高温”的原则进行反应;要达到高效率的连接,必须酶切完全,酶切的DNA数量要适当;另外,酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量,以及相应的所需酶的量;可以适当增加酶的用量,但是最高不能超过反应总体积的10%,因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中,如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%,就会抑制酶的活性;连接反应总是紧跟酶切反应,外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的;DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键;在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4DNA连接酶,它可以连接黏性末端和平末端;连接反应时,载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:1~3之间,可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象;反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间,一般是16℃,用常用的连接时间为12-16h;2.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化;能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞,即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态,它决定于受体菌的遗传特性,同时与菌龄、外界环境等因素有关;人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力,或人为地将DNA导入细胞内,该过程与细菌自身的遗传控制无关,常用热击法,电穿孔法等;能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关,所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株;目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法,制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油,-70℃可保存半年至一年;经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加,允许外源DNA分子进入;在低温下,将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合,经过热击或电穿孔技术,使载体分子进入细胞;进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达,使受体细胞出现新的遗传性状;将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养,即可筛选出重组子;本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞,用CaCl2处理,使其处于感受态,然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s,实现转化;3.重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后,并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子,一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖;并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起;再者,在这些被转化的受体细胞中,除部分含有我们所期待的重组DNA分子外,另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致;因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子,并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子;本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法;抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选,而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活,α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子;质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因Ampr,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子;没有导入质粒PUC19的受体细胞,在含有氨苄青霉素的平板上不生长;质粒PUC19进入E.coliDH5α后,通过α-互补作用,形成完整的β-半乳糖苷酶;在麦康凯培养基平板上,转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸,pH降低,培养集中的指示剂变红,转化子的菌落变红;不含质粒的E.coliDH5α,没有β-半乳糖苷酶活性,不能利用培养集中的乳糖产生有机酸,而是利用培养集中的有机碳源,不使培养基pH降低,在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落;重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部,不能形成α-互补作用,所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸,在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落;挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落,通过扩增培养;因为许多菌落存在假阳性情况,在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA 菌落,也可能是载体自连后发生突变的菌落,所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小,可将重组的载体DNA提取出来,进行后续的酶切、电泳检验;也以提取的重组质粒为模板,利用现有的引物,进行那个PCR扩增,检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒;4.PCR技术PCRPolymerasechainreaction即聚合酶链式反应,其原理类似于DNA的体内复制,又叫做“体外基因扩增”;反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+,4种脱氧核糖核酸dNTP、DNA聚合酶和合适的缓冲体系;反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程;这三个反应构成一个循环,反复进行;每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板;理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍,反复30次,特异DNA序列片段以指数方式可扩增105~106;通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR产物,因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术;现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的TaqDNA聚合酶,而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率;反应中用的引物有两段,一条称为上游引物或者正向引物,一条称为下游引物或者反向引物;引物的设计十分重要,在设计时应遵循以下原则：长度一般为18到24个碱基；G+C的百分含量在40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构,避免形成引物二聚体；最好以1到2个G或C碱基开始或结束；引物的5’端可以被修饰,但是3’端绝对不能进行任何修饰,而且引物的3’端要避开密码子的第三位;模板的浓度不能太大,dNTP的浓度为2.5mmol/L,金属离子的浓度为1.5mmol/L,缓冲液为pH为7.2~8.0的Tris —HCl溶液;二、实验材料：1.菌株：E.coliDH5α2.培养基：LB培养基、麦康凯培养基加入氨苄青霉素3.试剂材料：酶切反应：DNAPUC19质粒,酶切10×buffer,HindⅢ,重蒸水,λDNA;连接反应：酶切后的DNAPUC19质粒和λDNA,连接10×buffer,T4连接酶,重蒸水;感受态细胞的制备：0.1MCaCl2转化：连接液和感受态细胞,0.1MCaCl2,冰块;重组菌的挑选、检验：试剂盒含有RnaseA的溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer,酶切后的DNAPUC19质粒,试剂盒抽提的DNA,酶切10×buffer,HindⅢ,重蒸水,琼脂糖,TAE缓冲液;上样缓冲液,EB染液;PCR检测：10×PCRbuffer,dNTP,模板,引物1,引物2,水,TaqDNA聚合酶,琼脂糖,TAE、溴化乙锭EB4.仪器器材：20、200、1000ul的枪和枪尖,1.5ml的Ep管,恒温培养箱,水浴锅,平板,三角瓶,试管,接种环,牙签,酒精灯,火柴,冰箱,离心机,电泳槽,紫外仪,PCR扩增仪三、实验步骤载体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与电泳检测→PCR检测一酶切1、在两支Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分,混匀,适当离心,使样品集中于管底；酶切反应各成分添加如下：2、在37℃恒温水浴锅中反应1h以上;3.分别取上述酶切样品2~5uL,与1~2uL电泳上样缓冲液混合均匀,进行琼脂糖凝胶电泳,观察酶切反应是否彻底,剩余样品可以继续酶切;4.待电泳观察酶切反应完全后,将剩余样品从恒温水浴锅中取出,置65℃恒温水浴锅中保存10~15min,终止酶切反应5.样品可以直接进行酶切反应或者保存于-20℃冰箱备用二连接1、在Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分,混匀,适当离心,使样品集中于管底；连接反应各成分添加如下：3、连接产物可用于转化实验;三感受态细胞的制备1、用接种环从含有E.coliDH5α的培养基平板上挑取少量灰白色E.coli菌落接种到20mlLB培养基里,37℃振荡培养过夜;实验均在无菌条件下,以防污染；2、取37℃过夜培养物,此时的培养物较浑浊,颜色变深;按1%的接种量吸取200μl转接到20mlLB培养基中,37℃振荡培养2.5~3小时；3.分别取1.5ml菌液于2个无菌的1.5mlEppendorf管中,5000rpm离心5min,弃上清液,吸干；重复收集菌体一次,使菌量增多；每支离心管中加入用冰预冷的1ml0.1mol/lCaCl,漩涡震荡使细胞悬浮混匀,冰上放置15min,4℃5000rpm离心5min；4、弃上清液,吸干后,加入100ulCaCl悬浮冰浴至使用；上述方法制好的感受态细胞置于冰上,48h之内均可用于转化,分装成2x50ul和100ul三管;四转化实验1、取制备好并摇匀后的3管感受态细胞悬液,分别作如下处理：1感受态细胞悬液50uL+pUC19质粒DNA1uL2感受态细胞悬液50uL+DH5a3感受态细胞悬液100uL+连接产物5uL2、将以上各样品管轻轻摇匀,冰浴10min,在42℃水浴中热击90s,然后迅速置于冰上2~3min,质粒已经吸附到感受态细胞的表面,此时不能剧烈振荡,以增加转化效率；3、向上述3管中分别加入450ul、450ul和900ul新鲜的LB培养基混匀后,37℃摇床培养1~2h,使受体菌恢复正常生长状态;五稀释和涂布平板1、无菌操作,将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：⑴受体菌对照管：取50ul受体菌液分别涂布含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基；⑵pUC19质粒对照组：取50ul培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基；⑶重组质粒转化组：取50ul、100ul、150ul、200ul培养液分别涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基2、当菌液完全被培养基吸收后大约10min倒置培养皿,于37℃恒温培养24~36h,观察菌落生长情况红白菌落法;六重组子的筛选与鉴定1、取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板,在底部划线分成6个区域；在涂有重组质粒转化组的平板上分别选取6个单个的白色转化子,用接种针划线转接到平分成6份的含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上；37℃过夜培养；2、在划线的6个单菌落中选取4个,分别接种到含有5ml带氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜；七试剂盒抽提重组质粒DNA及鉴定1、分别取3ml菌液,用Omega试剂盒抽提重组质粒DNA,具体步骤见说明书；2.将pUC19质粒酶切及两组重组质粒酶切体系加入10loadingbuffer,混合均匀,进行琼脂糖凝胶电泳,电泳1h左右;1~2uL样品+1~2uLLB+1~2uL水注意事项1.本实验属于微量操作,用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中;2.实验中所用塑料器材都必须是新的,并且经过高温灭菌,操作时打开使用,操作过程中要注意环境干净,戴手套操作,尽量减少走动,缩短Ep管开盖的时间;3.不论是酶切还是连接反应,加样的顺序应该是,先加双蒸水,其次是缓冲液和DNA,最后加酶;且前几步要把样品加到管底的侧壁上,加完后用力将其甩到管底,而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出,酶管放置冰上,取酶液时吸头应从表面吸取,防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液;取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下,并充分混匀;4.Ep管的盖子应盖紧,防止水浴过程中水汽进入管内,并做好标记以防样品混淆;5.转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染,整个操作过程应在无菌条件下进行;6.电泳时使用的缓冲液最好是现配现用,以免影响电泳效果;7.制备凝胶时,应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长,否则溶液将会暴沸蒸发,影响琼脂糖浓度;制胶时要除去气泡;拔梳子时要特别小心,以防凝胶与支持物脱离;8.上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿;也不要快速挤出吸头内的样品,避免挤出的空气将样品冲出样品孔;9.溴化乙锭是一种强烈的诱变剂,有毒性,使用含有这种染料的溶液时,应带上乳胶手套进行操作;勿将溶液滴洒在台面上,实验结束后用水彻底冲洗干净;10.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害,对眼睛尤甚;观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽,并应戴好目镜或眼罩,避免皮肤直接暴露在紫外线下;11.实验中加样后应及时更换吸头,以避免试剂的污染;12.PCR反应高度灵敏,应设法避免污染,如戴一次性手套操作,使用一次性PCR管和吸头,反应加样区应与DNA模板制备区及PCR产物电泳检测区分开;13.PCR管单加样时,对于非常微量的样品一定将样品加在管壁上或者液体中,防止漏样;14.实际操作时,为了防止少加样,可以保存每次用过的枪尖,通过数枪尖知道自己加到哪一步了;五、结果与分析1、pUC19质粒DNA酶切结果目的基因与pUC19质粒载体酶切以后经过琼脂糖凝胶电泳,紫外成像如下：从左到右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII；第2、3泳道：λDNA及λDNA/HindIII；第4、5泳道：pUC19质粒及pUC19/HindIII；第6-15泳道：第1-10组的pUC19/HindIII样品；第16泳道：pUC19/HindIII；第17泳道：λDNA/HindIII；我所在组为第9组,为第14泳道所电泳样品;对比酶切时的Marker和商业酶切质粒,可知带①为线性pUC19质粒,带②基本上为未切开的双螺旋pUC19质粒;对比带①与带②可以发现,带①的亮度和宽度仅为带②的一半左右,所以说明有三分之二的双螺旋质粒没有被切开,具体原因可能为：酶切时间短；酶活性较低；酶切反应的buffer不合适等;2、转化结果质粒转化进入感受态细胞后,在培养基上进行涂布并过夜培养,第二天观察培养基培养情况;表4平板内菌落的正确生长状况但是我们组的平板内全部有很多菌落生长,可能原因有：1.操作不当,涂布时有其他液体混入2.氨苄失活3、重组质粒的筛选与鉴定1重组质粒进行酶切以后,进行琼脂糖凝胶电泳,得成像如下图本组使用的重组质粒来自其他组从左至右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII；第2泳道：pUC19质粒；第3-22：第1-10组的重组质粒R,R；我所在组为第9组,重组质粒为第19、20泳道;通过对比可以看出两个重组质粒连接的应该都是125bp的小片段六、实验小结1、总结与反思⑴溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套;⑵酶切反应的所有塑料制品Eppendorf管、吸头等必须是新的,并经过高温灭菌,操作时打开使用,操作过程不要求无菌,但要注意手和空气中杂酶的污染,因此要求环境干净,戴手套操作,尽量减少走动,缩短Eppendorf管的开盖时间；⑶感受态细胞必须从纯菌种开始;从划线纯化的单菌落开始,进行活化培养,不要使用多次转接或储存在4℃的培养菌液,其目的是为了保持菌株的纯度和活力；⑷培养时间：过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况;如果出现了问题,调整培养时间会有帮助：染色体断裂多,则增加培养时间；酶切出现问题,则减少培养时间；⑸菌体的彻底悬浮：如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在SolutionII加入后,变成一个外围几乎彻底裂解,往里不完全裂解,中间没有裂解的团块;这个团块在SolutionIII加入后,会有一部分蛋白质继续存在于溶液中,成为蛋白质残留的最大根源；⑹使用相对过量的试剂：这是适合所有核酸抽提的建议;试剂相对过量的好处是：稳定性好,纯度高,操作更简单;如果认为这样不经济,就少用一点菌体；⑺配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶,琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓；⑻限制性内切酶的酶切反应属于微量操作技术,无论是DNA样品还是酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系；2、思考题1从电泳图上如何判断质粒DNA是否单酶切完全答：没有酶切的质粒处于超螺旋状态,因此在电泳图上原则上只能看到超螺旋条带;单酶切后质粒处于线状,如果单酶切不完全可能出现超螺旋状态和线状质粒条带同时存在,可以添加原质粒未酶切样品及同种质粒酶切完全样品做Maker,通过对比单酶切后的质粒条带是否单一及是否为线性进行判断;2影响质粒DNA转化效率的因素有哪些答：准备用来制备感受的细菌的生长状态与密度,制备感受态时细菌应处于对数期或者对数前期；质粒DNA的数量、大小与构型,质粒DNA数量不应太多,而分子量越大的质粒转化效率越低,超螺旋质粒DNA的转化效率高于重组DNA,环状DNA转化效率高于线性DNA；进行转化所用的试剂的纯度、质量和器材的洁净程度；数否杂菌及外源DNA污染;。
重组质粒的连接、转化及筛选
重组质粒的连接、转化及筛选概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
表达质粒重组和转化的主要技术流程
表达质粒重组和转化的主要技术流程1.首先，需准备目的质粒和DNA的供体质粒，用于质粒重组实验。
First, the recipient plasmid and the donor plasmid needto be prepared for plasmid recombination experiment.2.将供体质粒进行酶切，以释放目的基因片段。
The donor plasmid is digested with enzymes to release the target gene fragment.3.将目的基因片段和目的质粒进行连接，形成重组质粒。
The target gene fragment is ligated with the recipient plasmid to form a recombinant plasmid.4.将重组质粒转化至宿主细胞中，使宿主细胞具有目的基因。
The recombinant plasmid is transformed into host cells to introduce the target gene into the host cells.5.转化宿主细胞的方法包括热冲击法、电穿孔法、化学法等。
Methods for transforming host cells include heat shock, electroporation, and chemical methods.6.通常使用大肠杆菌作为转化的宿主细胞。
E. coli is commonly used as the host cell for transformation.7.转化宿主细胞后，将细胞在含有选择性抗生素的培养基中培养。
After transforming the host cells, the cells are cultured in a selective antibiotic-containing medium.8.选择性抗生素可杀死未转化的细胞，只留下携带质粒的转化细胞生长。
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质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转载▼质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。
质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。
T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。
当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。
（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。
实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。
理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。
但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平末端的连接速度为粘性末端的1/10~1/100。
为了提高其反应活性，一般选择16℃较为合适。
外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。
随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。
选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。
所谓受体细胞（receptor cell）又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。
显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。
一般情况下，受体细胞的选择应符合以下基本原则：（1）便于重组DNA分子的导入；（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；（3）便于重组体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；（5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；（7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
以上是受体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要求即可。
原核生物细胞: 是较为理想的受体细胞类型，其原因是：（1）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入；（2）没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦；（3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；（4）原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。
至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。
大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。
体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。
本实验以大肠杆菌为受体的基因转移。
转化方法：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。
细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。
以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：（1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4）单链DNA转化因子的整合；（5）转化子的形成。
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。
因此在大肠杆菌的重组质粒DNA分子的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表方法之一是Ca2诱导的大肠杆菌转化法。
Ca2诱导的转化：细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。
其原理是将处于对数生长期的细菌置于0℃，CaCL2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。
此时加入DNA，Ca2又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。
经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。
Ca2处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105～106个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。
转化子的筛选以及鉴定：在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。
并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。
因此，如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来，然后进一步检测到含有期待重组 DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。
通常我们将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子，而含有重组DNA 分子的转化子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。
在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。
一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。
选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。
选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定，一般与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色剂等，相应的筛选（选择）方法包括抗药性筛选、插入失活筛选和显色互补筛选等。
在本实验中利用的是麦康凯培养基，用来筛选重组子。
质粒PUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。
在麦康凯培养基的平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，PH降低培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。
而含有外源基因片段的PUC质粒进入受体细胞后，不能形成互补的β-半乳糖苷酶活性而出现白色菌落，这样根据这个条件即可筛选重组子。
实验材料以及仪器PUC19的质粒、LB培养基、麦康凯培养基提取质粒试剂盒恒温振荡培养箱，高速离心机，旋涡振荡器，水浴锅，酒精灯，微波炉，天平，电子天平，分析天平，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，塑料薄膜，微量移液器，手套，记号笔。
LB培养基，抗生素氨苄青霉素(50ug/L)，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNA Marker k／HindⅢ实验步骤1 准备阶段1.1 培养基的制备LB培养基麦康凯培养基1.2 枪尖的准备1000ul、200ul、20ul的枪尖在枪尖盒内装好，贴上标签2.7.1 观察平板上菌落的生长情况：2.7.2 记录情况如上，其中不含Amp的平板上培养基变黄；2.7.3 在含有Amp的平板上涂有连接液的平板上可以看到白色的菌落，这就是我们所需要的连接上的重组子形成的菌落，挑选红色菌落中的单独的白色菌落进行划线培养；2.7.4 用牙签轻轻挑去白色菌在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上划线，尽量将平板合理利用，不要将培养基划破；2.7.5 做好标记，继续培养。