实验2 酶切 片段回收和连接
酶切、片段回收与连接黄华如（生命科学学院，生技091，29号）摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。
本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。
说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。
关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。
构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。
对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。
基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。
基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。
近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。
现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。
这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。
尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。
当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。
1 材料与设备1.1 试供材料大肠杆菌、质粒DNA1.2 试剂准备质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等1.3 实验设备及用具高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。
2 实验步骤2.1 提取质粒DNA这个步骤由老师完成2.2 酶切表一：质粒（bt2）双酶切体系表二：质粒（pet）双酶切体系试剂用量试剂用量Buffer 2ul Buffer 2ul质粒（bt2）4ul 质粒（pet）4ulBam1HI 1ul Bam1HI 1ulHindIII 1ul HindIII 1ulWater 12ul Water 12ul总体系20ul 总体系20ul酶切2h以上，酶切结束后，用1.2%琼脂糖检查双酶切效果。
2.3 片段回收1)使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。
胶块超过300mg时，请使用多个Column 进行回收，否则严重影响收率。
注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3)切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。
4)称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1mg=1ul进行计算。
5)向凝胶中加入胶块融化液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：凝胶浓度Buffer GM使用量1.0% 3个凝胶体积量1.0%-1.5% 4个凝胶体积量1.5%-2.0% 5个凝胶体积量6)均匀混合后室温15-25℃融化凝胶。
此时应间断震荡混合，是胶块融化（约5-10分钟）。
7)当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上述胶块融化液中加入10ul 3 M醋酸钠溶液（pH5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。
当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9)将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
10)将700ul 的Buffer WB 加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
11)重复操作步骤10。
12)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。
13)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30ul的灭菌蒸馏水或Elintion Buffer，室温静置1分钟。
14)室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
2.4 T4连接酶连接表三：T4连接酶连接体系试剂用量回收pet质粒4ul回收bt2质粒4ulT4 连接酶1ulT4 Buffer 1ul总10ul放置4°C连接过夜2.5 转化大肠杆菌质粒DNA转化大肠杆菌方法：1)把感受态细胞置于冰中；2)把50ul的感受态细胞转至连接的DNA中（10ng一下，昏匀）；3)冰中放置30分钟；4)42°C放置45--60秒；5)冰中放置2--3分钟；6)加入37°C预热更好的soc培养基，使终体积1ml；7)37°C振荡培养1小时（160--225r）8)取适量的菌液涂布琼脂糖培养基9)37°C过夜培养2.6 验证（PCR）表四：验证PCR体系试剂用量10xBuffer 2uldNTP 2.5ul引物1 0.5引物2 0.5ulTaq酶0.5ul加蒸馏水至25ulPCR条件：94℃4min，94℃45s，51℃45s，72℃1m30s，30个循环，72℃10min。
3 结果分析3.1 酶切结果（M：Maker2000；B：bt2质粒；P：pet质粒；1，2，3···：每组实验）图1 两种质粒的双酶切结果在图1中可以清晰的看到，bt2质粒被酶Bam1HI和酶HindIII切成两条带，而pet质粒则被切成一条带，在bt2质粒中，第一条较粗的带为目的基因，第二条是双酶切切除目的基因后剩下的基因；在pet质粒中，可以看到的只有一条带，其实在双酶切下，pet质粒也会有两条带的，只不过是切完后的两段片段的质量差不多，在电泳的时候没能跑开来。
由于bt2和pet质粒都是用相同的两种酶剪切，所以在在bt2质粒和pet质粒剪切下来的目的片段和载体片段都形成了相同的粘性末端。
我们每组的结果都很清晰很成功，只要成功的地方很有可能是bt2质粒和pet质粒的质量都非常高。
3.2 转化大肠杆菌结果图2 质粒DNA转化大肠杆菌图2中可以清晰的看到白色的斑点，转化的大肠杆菌。
由于目的基因中含有一些抗性基因，如，Amp、潮霉素等，而在培养基中也加有这如Amp、等的抗生素，能在培养基生长的细菌，它们的基因组里面应该是含有抗性基因的。
从图中可以看到很多白色的斑点，能够正常生长的大肠杆菌，这些大肠杆菌中成功的转入了含有bt2质粒的目的基因。
但是，这些白色的斑也有可能是假阳性，为了确定目的基因是否真正的转入大肠杆菌，还需要做PCR 验证。
3.3 验证的PCR结果（M：maker2000；1-6：本组大肠杆菌结果；7-8：老师提供大肠杆菌结果）图3 验证转化大肠杆菌PCR电泳图谱图3中，白色方框内的为1班6组的结果，左边的六个孔是点用自己转化大肠杆菌PCR 的结果产物，右边两个点是老师提供转化大肠杆菌PCR的产物，可以看到，我们自己转化的大肠柑橘在电泳图中没有跑出来，而老师提供的大肠杆菌就可以跑出来。
说明了我们自己转化的大肠杆菌虽然在抗生素培养基生存，但那是假阳性的大肠杆菌，而老师提供的大肠杆菌是成功转入了目的基因的阳性大肠杆菌。
4 讨论与分析4.1 讨论本实验所涉及的内容和步骤都非常多，有很多环节都是要注意的，这关系到整个实验的成功与失败，例如下面的这些：1)感受态细胞非常脆弱，要轻拿轻放，不能过分的摇晃，更不能激烈震荡；2)在做酶切和PCR过程中，尽量在冰上操作，保持低温环境；3)在进行加样的时候要有耐心，因为进行双酶切时加入的物品的量都是比较少的，所以要特别留意。
特别是在把取出的样品加入到PCR管的时候更要注意，因为量太少，所以要粘着PCR的管壁来放样；4)转化实验中所使用的玻璃仪器，微量吸管，离心管等应该彻底清洗干净，并进行高温高压消毒灭菌，表面去污剂、化学试剂的污染残留会大大减低转化率。
微量吸管应该剪去尖端扩大口径。
4.2 分析质粒的重组和转化是基因工程的关键所在，所谓的基因的工程就是将真核细胞的基因能在原核细胞中成功地表达，这个实验通过质粒的重组和转化，这对基因工程的研究很有帮助的。
在基因工程中，目的基因获取的途径有很多：从基因文库或cDNA文库中获取所需的目的基因；更具目的基因的序列来合成所需的目的片段；通过PCR扩增技术来获得所需的目的片段。
而本实验就是通过PCR扩增技术来获取质粒DNA的，在进行电泳检测目的基因，可能会出现无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性、假阴性的现象。
参考文献：[1] 梁红，梁雪莲. 生物技术综合实验教程[M]. 北京：化学工业出版社，2010.。
双酶切实验
双酶切概述双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“se q”标注。
[编辑本段]双酶切的注意事项1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。
【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。
双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
酶切连接经验之谈
酶切本实验室条件下酶切连接经验之谈1、PCR产物可以切胶回收后酶切，用Elution buffer溶解即可，不影响后续实验。
2、50ulPCR产物切胶回收后用35ul Elution buffer溶解后只需取一半体积用于后续实验即可满足要求。
3、PCR产物可以用乙醇沉淀法获得DNA用于后续反应，但需取少于一半的量用于后续实验，否则会不能完全切开而导致实验失败。
4、双酶切时，若2种酶不是同一厂家时，可以根据Thermo厂家该2种酶的共同buffer，选用Tango缓冲液，一般50ul体系各加1ul酶，而快切酶只需0.5ul,切3小时即可。
5、添加酶切试剂时，应先将buffer和样品振荡均匀后再加入相应的酶，轻弹混匀即可。
6、观察酶切后的载体片段会比质粒大很多，PCR产物双酶切后的片段也比未酶切时要大，并且酶切后产物有时会呈现稍微弥散的宽带，由此可以判断是否切开。
7、部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。
大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。
而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。
而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
8：E.coli JM110要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化.若酶切不成功可以考虑以下因素的影响a)有些内切酶对PCR产物酶切效率较低b)双酶切无共同buffer时，可以采用分步酶切c)PCR产物直接双酶切不成功，可以选择先做TA克隆后再双酶切d)当载体的2个酶切位点很接近，或者其中一个酶切效率很差时，可以对载体进行去磷酸化，该酶为牛小肠碱性磷酸酶，在大多数限制酶缓冲液中均有活性e)导致“星星活性”可能是体系中甘油浓度过高、高PH、较低的离子强度所致。
DNA的限制性酶切胶回收与连接
DNA的重组连接的原理
DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA， 通过DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸 与3’端羟基之间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。
本实验利用T4DNA连接酶，有Mg2+、ATP存在的连接反 应体系中，将载体puc18与目的基因sod连接起来。
连接体系（10ul）：
琼脂糖凝胶回收的原理：
不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中泳动速度不一样 而分离。
NaI存在条件下，加热至55℃，含有DNA片段的琼脂糖凝胶就 会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分子，从而得到纯净 的DNA片段。
硅胶树脂在酸性高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA， 通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐浓度下其与 DNA的结合能力会急剧降低，如使用弱碱溶液如TE(pH8.0)就 可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段。
它能够识别并结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列，在 该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二酯键，切断DNA 双链结构。
限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸， 具有回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列，或 称为反向重复序列 ）特征。
在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是HindⅢ和 EcoRⅠ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可 以保证酶切产物与载体正确的连接。
注意事项：
溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故切胶时应使 用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。
切胶时，尽量沿目的片段边缘切下，使其所带的琼脂糖 尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。
将目的DNA吸附在Genclean柱上，要重复回收一次，以 提高目的DNA的回收效率。
实验2 酶切 片段回收和连接
酶切、片段回收与连接黄华如（生命科学学院，生技091，29号）摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。
本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。
说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。
关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。
构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。
对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。
基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。
基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。
近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。
现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。
这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。
尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。
双酶切连接反应
双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
酶切和连接
双酶切：载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。
我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。
我的酶切体系如下：质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng）(NEBlack Eye SfiⅠ1ul(NEBlack Eye BssHⅡ1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul水14.8ul总体积20ul50度，2小时。
切出了370bp左右的片段，回收载体。
然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。
证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。
50度3小时我试过，但是质粒有降解。
酶量应该说是过量的。
请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。
如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。
但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。
在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。
相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。
实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。
这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。
ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。
不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。
现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。
在瓜作用的底物。
如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。
《酶切回收连接》课件
连接
01
连接是将两个DNA片段 通过特定的连接酶连接 在一起的过程。
02
连接的目的是为了将目 的基因与载体DNA进行 重组，以便进行转化和 克隆等操作。
03
连接过程中需要注意连 接效率和特异性，避免 非特异性连接和自连等 副反应。
04
连接后的DNA分子需要 进行转化和筛选等操作 ，以便获得重组的克隆 和表达载体。
05
酶切回收连接的注意事项
酶切反应的条件控制
酶切缓冲液
确保使用正确的酶切缓冲液，以提供 适宜的离子环境和pH值，确保酶的 活性。
酶浓度
根据酶的活性确定最适的酶浓以确保酶切反应的 稳定进行。
时间控制
根据实验需求，选择合适的时间进行 酶切反应，避免过长或过短的时间影 响酶切效果。
胶回收的注意事项
胶的选择
根据DNA片段大小选择合适的 凝胶浓度，以确保DNA片段能
够有效地分离。
电泳缓冲液
使用新鲜的电泳缓冲液，以确 保良好的导电性和分离效果。
切割时间
控制电泳时间，避免过长或过 短的时间导致DNA片段的损失 或分离效果不佳。
回收效率
选择高效的胶回收试剂盒，以 确保高回收率。
连接反应的条件控制
04
酶切回收连接的实验操作
酶切反应
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酶切反应原理
酶切反应利用限制性内切核酸酶特异性切割DNA 分子，产生特定大小的DNA片段。
酶切反应条件
限制性内切核酸酶的最适反应温度、pH值、离 子浓度等，以及所需的DNA浓度和反应时间。
3
酶切反应步骤
加入限制性内切核酸酶、缓冲液和DNA模板，进 行特异性切割，然后进行后续处理。
的连接和转化等步骤。