蛋白表达纯化实验步骤
蛋白纯化的步骤
蛋白纯化的步骤嘿，咱今儿就来说说蛋白纯化这档子事儿哈！你想想看，蛋白就像是一群调皮的小孩子，在那乱糟糟的环境里跑来跑去，咱得想办法把咱想要的那个小家伙给揪出来，让它干干净净、清清爽爽的，这就是蛋白纯化啦！首先呢，得准备好材料和工具，这就好比要出门得先找好鞋子和包包一样重要。
咱得有合适的缓冲液，就像是给蛋白们准备的舒适小窝。
然后呢，就是细胞破碎这一步啦！这就像是打破一个大罐子，把里面的东西都给放出来。
把细胞弄破，让蛋白们从里面跑出来。
接着呢，就是离心啦！这就好像是把一堆东西放到一个大转盘上，转啊转，重的就沉下去了，轻的就浮在上面啦。
通过离心，把那些杂质啊啥的都给分离开。
然后呢，就是过滤啦！这就像给蛋白们过筛子，把那些大块头的杂质都给筛掉，留下咱们要的那些细细小小的蛋白。
再接下来就是关键的层析啦！这可就像是走迷宫一样，不同的蛋白会在这个迷宫里走不同的路，咱就可以根据它们的特点把它们给分开啦。
这里面又有好多不同的方法呢，什么离子交换层析啦，凝胶过滤层析啦，亲和层析啦，每种都有自己独特的用处。
离子交换层析呢，就像是蛋白们根据自己带的电荷来选择走哪条路，带正电的走这边，带负电的走那边。
凝胶过滤层析呢，就像是根据蛋白的大小来决定它们走的快慢，大的走得慢，小的走得快。
亲和层析就更厉害啦，就好像是蛋白们看到了自己最喜欢的东西，一下子就粘上去啦，其他的就被淘汰掉啦。
哎呀呀，你说这蛋白纯化是不是很有意思啊！把那些乱七八糟的蛋白一点点地给弄清楚，给分离开，就像是在玩一个超级有趣的游戏一样。
等咱把蛋白纯化好了，那可就像是得到了宝贝一样开心呢！可以用来做各种实验啦，研究啦，为科学做出贡献啦！这可不是一件简单的事儿哦，但只要咱认真去做，肯定能成功的。
所以啊，蛋白纯化虽然步骤不少，但只要咱有耐心，有细心，有决心，就一定能把那些调皮的蛋白小家伙们给收拾得服服帖帖的！你说是不是呀！。
蛋白质的表达纯化
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
蛋白质的表达纯化
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
蛋白质的表达纯化
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
• 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流 出液。
• 4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱， 分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
• 5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1 mL， 共收集6－10管，分别取1蛋0白u质l样的表品达纯用化于SDS-PAGE 分析。
蛋白质的表达纯化
实验步骤
• 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 • 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌
BL21菌株于5mL LB液体培养基中 （含100ug/mL 氨苄 青霉素），37℃震荡培养过夜。 • 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉 素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 • 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. • 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于20℃或-70℃冰箱中。
蛋白质的表达纯化
• 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配
方如下：
30%Arc- Tris-HCl H2O
Bis
gst纯化蛋白步骤
gst纯化蛋白步骤GST纯化蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法，它利用谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)的亲和性，将GST标签蛋白与GST结合亲和树脂进行结合，然后通过洗脱，最终得到纯化的目标蛋白。
下面将为大家介绍GST纯化蛋白的详细步骤。
1.构建重组蛋白表达载体：首先需要在目标蛋白编码基因的N端或C端加上GST标签，通常选择GST-N和GST-C两种方式。
将GST标签与目标蛋白基因连接后，将其插入合适的表达载体中。
2.转化宿主细胞：将构建好的重组表达载体转化到适合的宿主细胞中，常用的宿主细胞有大肠杆菌和酿酒酵母等。
3.表达目标蛋白：宿主细胞在适宜的培养条件下进行培养，使其产生大量重组蛋白。
常见的培养条件包括温度、培养基的选择和添加诱导物等。
4.细胞破碎：培养得到丰富的重组蛋白的细胞后，通过机械或化学方法将细胞破碎。
常用的方法有超声波破碎、高压均质破碎、冻融法和溶菌酶法等。
5.蛋白纯化：将细胞破碎液进行离心分离，去除残余细胞碎片。
接下来，将蛋白样品加入含有GST结合亲和树脂的柱子中，通过亲和吸附，在树脂上富集GST标签蛋白。
6.洗脱纯化蛋白：使用合适的洗脱缓冲液，可以脱离与亲和树脂结合的非特异性结合蛋白，并洗脱纯化的目标蛋白。
一般使用还原性缓冲液，可将目标蛋白从GST结合亲和树脂上彻底洗脱。
7.蛋白质浓缩：通过合适的方法，如超滤、溶液浓缩装置等，使纯化的目标蛋白浓缩到较高浓度。
8.纯化蛋白的分析：对纯化的目标蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，检测其纯度和分子量等指标。
通过上述步骤，可以得到较高纯度的GST标签蛋白。
需要注意的是，在步骤的选择和操作过程中，要根据目标蛋白的特性和所需纯度等要求进行调整，以获得更好的纯化效果。
希望本文对您进行GST纯化蛋白的实验有所帮助。
蛋白表达纯化流程
第一章蛋白表达纯化一、诱导表达分析1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化2.1重组蛋白的提取2.1.1 提取缓冲液20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。
如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。
还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。
7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。
蛋白分离纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质分离纯化的基本原理和操作方法。
2. 学习不同分离纯化技术的应用。
3. 提高实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和功能。
蛋白质分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
本实验采用多种分离纯化技术，包括：材料预处理、细胞破碎、离心分离、沉淀分离、膜过滤分离和色谱分离等，实现对蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR产物、琼脂糖、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、玻璃棒、培养箱、无菌操作台等。
四、实验步骤1. 蛋白质提取（1）将大肠杆菌细胞培养至对数生长期。
（2）收集细胞，用玻璃棒搅拌，加入预冷的提取缓冲液，低温条件下进行细胞破碎。
（3）离心分离，取上清液即为蛋白质粗提液。
2. 蛋白质沉淀（1）向蛋白质粗提液中加入一定量的硫酸铵，搅拌溶解。
（2）离心分离，收集沉淀，即为蛋白质沉淀。
3. 蛋白质溶解（1）将蛋白质沉淀溶解于适量的缓冲液中。
（2）调整pH值，使蛋白质处于适宜的溶解状态。
4. 蛋白质分离纯化（1）离子交换色谱：将蛋白质溶液上样至离子交换柱，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
（2）凝胶过滤色谱：将蛋白质溶液上样至凝胶过滤柱，用缓冲液进行洗脱，收集目标蛋白峰。
5. 蛋白质鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质分子量。
（2）考马斯亮蓝R-250染色：观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质提取：通过细胞破碎和离心分离，成功提取出大肠杆菌细胞中的蛋白质。
2. 蛋白质沉淀：硫酸铵沉淀法成功地将蛋白质从粗提液中分离出来。
3. 蛋白质溶解：调整pH值后，蛋白质成功溶解于缓冲液中。
4. 蛋白质分离纯化：离子交换色谱和凝胶过滤色谱成功地将目标蛋白从粗提液中分离出来。
提取纯化蛋白实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质提取纯化的基本原理和方法。
2. 学习蛋白质纯化过程中的操作技巧和注意事项。
3. 通过实验验证蛋白质提取纯化的效果。
二、实验原理蛋白质提取纯化是指从生物材料中提取目标蛋白，并通过一系列的分离纯化步骤，去除其他蛋白质、核酸、脂质等杂质，获得高纯度的目标蛋白。
实验中常用的提取纯化方法有：细胞破碎、抽提、沉淀、分级、除盐、浓缩等。
三、实验材料1. 生物材料：细胞、组织、血清等。
2. 试剂：盐酸、稀SDS、有机溶剂、稀碱、硫酸铵、透析袋、超滤膜、Ni柱等。
3. 仪器：匀浆机、离心机、电泳仪、凝胶层析仪等。
四、实验步骤1. 前处理：根据生物材料的不同，选择合适的细胞破碎方法，如动物细胞用匀浆机、组织捣碎机或超声波；植物细胞用石英砂研磨或纤维素酶处理；微生物用超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等。
2. 抽提：根据蛋白质的性质选择合适的抽提方法。
可溶蛋白用盐酸、脂蛋白用稀SDS或有机溶剂、不溶蛋白用稀碱进行抽提。
抽提原则为少量多次。
3. 粗提：去除糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。
常用方法有沉淀法（核酸沉淀法、蛋白沉淀法、选择变性）、分级法（盐析或有机溶剂）。
4. 除盐和浓缩：去除蛋白质中的中性盐，常用方法有透析法、分子筛；浓缩方法有反透析、冻干、超滤等。
5. 精细分离：采用凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等方法对蛋白质进行精细分离。
6. 鉴定：采用SDS-PAGE、Western Blot等方法鉴定蛋白质的纯度和活性。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过上述步骤，成功提取纯化了目标蛋白，并进行了鉴定。
2. 结果分析：根据SDS-PAGE和Western Blot结果，目标蛋白的纯度达到90%以上，活性得到验证。
六、实验讨论1. 实验过程中，选择合适的细胞破碎方法、抽提方法和分离纯化方法对蛋白质的提取纯化至关重要。
2. 实验过程中应注意操作技巧，如防止蛋白质降解、避免氧化等。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
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蛋白表达纯化实验步骤（待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA.2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA。
4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒.6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami（DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。
6左右，加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达）。
2)SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50％以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带.3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围.甘油是用0。
22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30％—60％，使用时自己计算用量.4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度,低转速(140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融.8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD>=1。
5，约5h左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2。
5h～3h)，然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。
另一方法是，将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。
3）过夜摇菌,使用包涵体检测的温度（18°左右)，转速140rpm左右.4）将菌液6000rpm,4min，4度离心收集菌体。
加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。
每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。
可用4支50ml 的离心管同时离心，但是,离心管要重复使用，用完后洗净保存。
10、超声波裂解.1）用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作，7s休息，50min即可.注意：1.要冰浴。
2.要随时观察裂解情况以防意外。
3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。
一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡.4.正常声音为:孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因,要及时调整.溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关）。
注意：1。
如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF），PMSF工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解.11、取得上清1)将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。
10000rpm,15min,4°离心.沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。
（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7。
5左右。
平衡buffer的pH是7。
8左右，裂解后上清就会在7.5左右.）12、纯化上清—-—摸洗脱条件。
1)镍柱处理。
将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。
（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。
)取20μl过柱后的样品，以备跑胶。
3)分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。
每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。
每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP 管中,以备跑胶.注意:理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。
实际上测不到零,怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了.4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。
上样量为4。
5ml(将前面的0.5ml单独接入EP管,再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。
5)加MES将NI柱重生。
MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O.流完后保存于2倍体积的20％乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。
(尿素可能对NI柱有损伤.）注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。
镍柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7。
8 ，上清pH=7。
5 ，Wash Buffer pH=7。
0 ，Elution Buffer pH=7.2.13、跑胶验证。
1）跑2块0。
75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。
2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右.(也可以300V,30min,只是图没有160V好看。
）4）考马斯亮蓝染色。
一般染色2h即可。
5)脱色。
先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。
14、纯化上清——-收集目的蛋白1)将重生的镍柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3ml)。
2）重复步骤12中的操作,只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。
15、跑胶验证。
同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。
16、透析.1)配制2L透析液(配方见附件1)，并放于—20度冰箱预冷但不要结冰。
2)透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗净。
3)用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中,置入提前预冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl)中。
冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1。
5h后换液。
透析3次即可.注意：用广口瓶装透析液,将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。
冰浴以防活性降低。
17、浓缩。
1)将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。
2)30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。
3)每隔10min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩。
4）透析袋用完后，洗净，保存于20％乙醇中4°存放。
注意:浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高,不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。
如果看不到,可根据自己估计的蛋白量留1—2ml体积.用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存.18、超滤法浓缩、透析蛋白。
使用超滤法就可省去16、17两步.1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。
2)配平。
3)7400g，30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右.浓缩4倍。
可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。
可以几次的Elution液一起浓缩.4）加入需要的蛋白储存液至4ml，离心.重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液.蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。
如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油(1%-5%即可）助溶。
5）收集。
将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度(测量后)，制备日期。
注:超滤管的使用方法见附件419、蛋白浓度测定.见附件320、蛋白活性测试。
转染细胞测量荧光。
21、抗原处理。
蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状.22、注射兔子.选择合适的注射方式和合适的免疫程序。
23、收集免疫血清.提取抗体。
24、抗体效价评定。
附件1所需溶液配方:1）20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7。
4试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4—12H2O NaCl用量(g）1L 0。
5928 5.802192 17。
5322）Equilibration Buffer(平衡缓冲液): PBS with 10 mM 咪唑pH 7.43)Wash Buffer（清洗缓冲液)：PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH 7。
44）Elution Buffer（洗脱缓冲液)：PBS with 250 mM 咪唑pH 7.45）MES(再生缓冲液）: 20 mM 2-（N—morpholine）-ethanesulfonic acid, 0。
1 M sodium chloride; pH 5。
0。
即0。
3904g MES+0.5844g NaCl。
6)透析袋处理液: 2%（w/v）碳酸氢钠和1 mmol/L （pH8。
0）EDTA7）透析液：20mM PBS+50 mM NaCl（2。
92g）试剂名称NaH2PO4—2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量（g）1L 0。
5928 5。
802192 2。
92gTIPS:1—4的溶液可以一起配制。
先配10ml 8M的咪唑。
再配1L的PBS，用500ml水将试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的8M咪唑。
最后,定容。
Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml,Equilibration Buffer配了300ml。
PBS配了500ml.附件2包涵体检测1。
摇10ml菌，加0.5％葡萄糖和相应抗性。
培养至OD600=0。
5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温(16—25度)诱导过夜（也可不离心，在原来LB中直接加IPTG）。
在离心前取500μl菌液作为负对照,诱导完成后取500微升作为正对照。
正负对照不用超声波裂解,直接煮沸10min跑胶。