基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱
在寡糖结构分析中的应用
项目完成单位：国家生物医学分析中心
项目完成人：刘炳玉谷苗桑志红王鸿丽刘峰魏开华杨松成
1.前言
寡糖和多糖具有调节抗体水平、增强免疫功能、抗肿瘤、抗感染等作用,在肝炎、风湿病和爱滋病等重大疾病诊疗上应用价值大。

它还具有抗消化性溃疡、降血糖、降血脂、抗血栓、抗辐射、抗毒物损伤、抗晕、祛痰镇咳、诱导干扰素产生、促进血功能恢复以及促进蛋白质和核酸的生物合成等方面的生物活性，在国内外（尤其我国传统医学中）应用十分广泛。

糖类化合物结构比蛋白质和核酸复杂得多，包括单糖及其衍生物、寡糖、多糖、复合多糖和糖苷类，糖链由含多元羟基并顺反异构环状己或戊糖通过苷键连接而成,各单糖有五个手性碳且连接位置和构型多种多样。

要阐明一种糖结构,必须了解: (1) 分子量;(2) 单糖残基组成; (3) 单糖残基间的顺序; (4) 单糖残基在糖苷键中的位置; (5) 环状结构的类型; (6) 糖苷键的构型。

糖的组成复杂,结构相似,没有显色基团,难以不经衍生就进行光谱、色谱分析,但质谱不受此影响。

早期研究糖结构的质谱方法主要是快原子轰击电离质谱（FAB-MS），可以显示碎片离子,但有时候检测不到分子离子峰，而且，FAB-MS的分子量范围小、灵敏度不高[1]。

以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI－TOF－MS) 和电喷雾质谱（ESI-MS）为代表的生物质谱打开了质谱分析研究生物大分子的新领域,并很快发展成为能在多个层次上分析研究生物分子的生物质谱学(Biological Mass Spectrometry , BMS) [2-4]。

近年来，ESI－MS已在糖的结构分析中显示出强大的生命力。

它无需衍生化就能确定寡糖的结构、聚合度及组成，并能精确测定糖蛋白的分子量及其中寡糖的序列及结构均一性，还能区分寡糖是O一还是N－连接的，常被用于糖型（glycoform）的分析[5]。

但是，ESI-MS受样品中的无机盐和溶剂中干扰物的影响比较大，常导致其表观灵敏度不高。

相反，MALDI-TOF-MS的干扰物忍受力要比ESI-MS强得多，它的表观灵敏度比ESI-MS高；MALDI-TOF-MS的图谱因为没有ESI－MS中的多电荷特性而更容易解析。

另外，MALDI-TOF-MS的样品制备以及仪器调节也比ESI－MS系统简单。

因此，MALDI-TOF-MS成为当前研究蛋白质等生物大分子的首选技术。

Hillenkamp等[6]人报道了用MALDI-TOF-MS精确地测定ng级的葡聚糖，分子量达7000 u。

另外，源后裂解技术
(PSD) 通过将侧链或骨架打断，从碎片的质量数分布可推测母离子的结构，主要用于糖链结构以及取代基种类、取代位置、分布情况以及取代数量等情况的研究[7-8]。

2. 材料与方法
2.1 材料
糖样本SXY1306系列，SXY1572系列，SXY13000系列。

“酸水解及GC法”定性分析单糖组成，LC分析表明相对纯度大于97％。

基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-CCA）、芥子酸（SA）、2，5-二羟基苯甲酸（DHB）均购自Bruker 公司。

三氟乙酸（TFA）、乙腈（ACN）均为美国进口试剂。

实验用水为MilliQ处理后的水。

2.2 仪器
德国Bruker 公司MALDI-TOF-MS（Autoflex）；糖样本SXY1306和SXY1572系列（分子量小于2000U）用反射检测方式，飞行管长1.70M；SXY13000系列（分子量大于10000U）用线性检测方式；飞行管长1.22M；氮激光器波长337nm。

2.3 方法
样品：取各样品适量，用含/不含0.5% TFA溶剂溶解。

基质：将CCA、SA、DHB 分别溶于含/不含0.1% TFA 的50% 乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液。

点靶：取SXY1306系列和SXY1572系列各1u l，分别和1u l的CCA及DHB混合，取1u l 点于Scout384样品靶上；取SXY13000系列1u l，分别与1u l DHB、SA及CCA混合，取1u l 点于Scout384样品靶上，待自然干燥后置仪器中测定。

3. 结果与讨论
3.1 基质的筛选
采用负离子检测方式。

对于SXY1306系列和SXY1572系列（分子量小于2000U），重点比较DHB与CCA的差异；结果表明：两者在“灵敏度、准确度等”方面并无明显差异（图1 A ,B），这与大多数文献报道的略不同。

对于SXY13000系列（分子量大于10000U），重点比较SA与CCA的差异。

结果表明：SA的灵敏度明显优于CCA（图2）。

准确度上未发现明显差异。

3.2 检测方式
对于SXY1306系列和SXY1572系列，两种方式均可得到样品离子峰，但负离子方式比正离子方式的加成峰等杂峰少（图1C , D）。

另外，在正离子方式时，DHB比CCA略
好（加成峰等杂峰少）。

负离子方式时，两种基质无明显差异。

由此可见，正离子方式在检测小分子量的糖时，主要问题是产生一些基质等对样品的加成离子，使得谱图解析难点增加。

另外，正离子方式可能有助于产生一些寡糖碎片峰，这有利于寡糖结构解析。

关于“正离子方式下寡糖的源内裂解”问题正在进一步研究。

对于SXY13000系列，DHB,CCA,SA三种基质的正离子方式均未检测出样品离子峰。

说明，随着分子量的增加，糖链环和氧桥捕获氢离子的能力大大下降。

相反，负离子条件下，活泼氢仍可以较容易的被基质负离子夺走。

因此，正、负离子检测大分子量糖类时，可以部分反映出糖链的空间折叠情况。

3.3 制样方法
质谱的制样技术对分析结果有比较重要的影响。

传统的寡糖样品常在碱性条件下进行（如氨水体系，碳酸氢铵体系等），但实验观察到，碱性对于基质结晶有一定的负面影响（颗粒太大），而且也难以在正离子方式检测（通过正负离子检测确认分子离子峰是很有效的方法）。

因此，本项目探索的方法是：纯水体系（不加TFA、甲酸等酸化试剂）。

3.4 PSD技术研究寡糖结构
SXY1306系列和SXY1572系列样品，采用13步收集策略，对m/z1572等高丰度离子峰进行了PSD分析。

结果表明：负离子PSD比正离子方式的离子碎片少得多；而正离子方式下的PSD的碎片分析较复杂，需要专门的分析软件。

另外，对于寡糖，正离子方式中的加成离子的问题对于PSD分析并无影响。

A B
图1 基质对寡糖的MALDI-TOF-MS的影响（A）CCA 负离子（B）DHB负离子
（C）CCA 正离子（D）DHB 正离子C
D
参考文献
1 Yoko Ohashi, etc. Analysis of sugar epimers using mass spectrometry: N-acetyllactosamine-6,6′-disulfate and the 2′-epimer. Eur. J. Mass Spectrom.，2004，1：269 - 278
2 杨松成. 蛋白质组学中的有机质谱. 现代科学仪器，2000，5：9
3 赵晓光，薛燕，刘炳玉. MALDI－TOF质谱仪关键技术及进展. 现代仪器，2003，4：17
4 M. Karas, U. Bahr, A. Ingendoh, F. Hillenkamp, Introduction of MALDI-TOF. Angew. Chem. 1989, 101：805-806
5 刘翠平，方积年. 质谱技术在糖类结构分析中的应用. 分析化学，2001，29（6）：716－720
6 B. Stahl, A. Linos, M. Karas, F. Hillenkamp, M. Steup. Analysis of fructans from higher plants by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analyt. Biochem. 1997，246：195-204
7 王杰，杨松成，吴胜明，王红霞，魏开华，张学敏. 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱源后衰变技术鉴定蛋白质. 药学学报，2004，39（8）：627-630
8 Joseph Zaia. Mass spectrometry of oligosaccharides. Mass Spectrometry Reviews, 2004, 23：161– 227。