扬州大学《现代分子生物学》5分子生物学研究方法
畜牧学专业《现代分子生物学》课程
畜牧兽医科技信息2022年第11期《现代分子生物学》是从分子水平研究生命本质的一门生物学前沿学科。
它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息传递中的作用和功能为主要研究内容，是当前生命科学中发展最快并正成为与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。
通过本课程的学习有利于学生掌握遗传信息的传递和表达机制，了解这门学科发展过程中重大发现的实验设计过程以及对遗传物质进行操作的基本实验技术，有利于培养和训练学生探索生命的奥秘，对学生的科学研究性思维和探索生命及自然畜牧学专业《现代分子生物学》课程教学探讨胡序明，陈世豪★（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2022.11.009摘要：现代分子生物学是一门前沿性强、发展迅速、对生命科学领域各分支科学具有广泛和深入影响的学科。
为了使学生能够发现和认识生命科学领域中的分子生物学现象，具备一定的剖析能力，本文结合畜牧学专业现代分子生物学的教学实践，从教师队伍结构、课程教学内容以及教学方法和考核方法三个方面进行了初步探讨。
关键词：分子生物学；畜牧学；教学模式；教学考核基金项目：扬州大学教改课题（YZUJX2020—C16）作者简介：胡序明（1986~），重庆奉节人，博士，助理研究员，从事分子生物学技术研究。
★通信作者能，以及观察问题、分析问题和解决问题的能力，从而能够较全面地提高学生的基本素质。
通过实验技能考核（表1），可帮助学生形成科学概念、理解和巩固理论知识，正确掌握实验的基本方法和基本技能。
4结语微生物在自然中分布广泛，种类繁多，需借助仪器才能观察到微生物的形态和大小。
有益微生物对医药、工业、农业、畜牧业和科学研究产生重大影响；而有害微生物对人类、动物和植物致病，甚至危及生命。
为了让学生对微生物有初步的认识，需进行实验教学改革，通过实验讲解、实验操作，使学生根据微生物的培养特征、形态、特殊结构、生化特性及免疫实验鉴定微生物，学会应用微生物快速鉴定和自动化分析方法区别多种微生物，培养学生在实践中综合运用所学的知识去解决一些实际生产问题。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
《现代分子生物学》第三版 (朱玉贤 李毅 主编)课后习题答案 高等教育出版社
现代分子生物学课后习题及答案（共10章）第一章绪论1. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？2. 分子生物学研究内容有哪些方面？3. 分子生物学发展前景如何？4. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么？答案：1. 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。
狭义：偏重于核酸的分子生物学，主要研究基因或 DNA 的复制、转录、达和调节控制等过程，其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。
分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。
所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。
这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。
这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。
阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。
2. 分子生物学主要包含以下三部分研究内容：A.核酸的分子生物学，核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。
由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。
由于 50 年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。
研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因达调控和基因工程技术的发展和应用等。
现代分子生物学（第3版）_课后答案-五章
第一章 绪论1， 简述孟德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
答：孟德尔的对分子生物学的发展的主要贡献在于他通过豌豆实验，发现了遗传规律、分离规律及自由组合规律；摩尔根的主要贡献在于发现染色体的遗传机制，创立染色体遗传理论，成为现代实验生物学奠基人；沃森和克里克在1953年提出DAN 反向双平行双螺旋模型。
反向双平行双螺旋模型。
2， 写出DNA 和RNA 的英文全称。
答：脱氧核糖核酸（答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid DNA, Deoxyribonucleic acid DNA, Deoxyribonucleic acid））， 核糖核酸（核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid RNA, Ribonucleic acid RNA, Ribonucleic acid））3， 试述“有其父必有其子”的生物学本质。
答：其生物学本质是基因遗传。
子代的性质由遗传所得的基因决定，而基因由于遗传的作用，其基因的一半来自于父方，一般来自于母方。
自于父方，一般来自于母方。
4， 早期主要有哪些实验证实DNA 是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。
答：一，肺炎双球菌感染实验，答：一，肺炎双球菌感染实验，11，R 型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。
型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。
22，S 型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。
型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。
33，用加热的方法杀死S 型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡；后注入到小鼠体内，小鼠不死亡；二，噬菌体侵染细菌的实验：二，噬菌体侵染细菌的实验：11，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。
，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。
2 2 2，，DNA 中P 的含量多，蛋白质中P 的含量少；蛋白质中有S 而DNA 中没有S ，所以用放射性同位素35S 标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P 标记另一部分噬菌体的DNA DNA。
畜牧学专业《现代分子生物学》课程教学探讨
2023年第11期《现代分子生物学》是从分子水平研究生命本质的一门生物学前沿学科。
它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息传递中的作用和功能为主要研究内容,是当前生命科学中发展最快并正成为与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。
通过本课程的学习有利于学生掌握遗传信息的传递和表达机制,了解这门学科发展过程中重大发现的实验设计过程以及对遗传物质进行操作的基本实验技术,有利于培养和训练学生探索生命的奥秘,对学生的科学研究性思维和探索生命及自然规律的实践具有重要意义。
本文结合畜牧学专业现代分子生物学的教学实践,将从教师队伍结构、课畜牧学专业《现代分子生物学》课程教学探讨胡序明,陈世豪★(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009)D O I :10.3969/J .I SSN.1671-6027.2023.11.006摘要:现代分子生物学是一门前沿性强、发展迅速、对生命科学领域各分支科学具有广泛和深入影响的学科。
为了使学生能够发现和认识生命科学领域中的分子生物学现象,具备一定的剖析能力,本文结合畜牧学专业现代分子生物学的教学实践,从教师队伍结构、课程教学内容以及教学方法和考核方法三个方面进行了初步探讨。
关键词:分子生物学;畜牧学;教学模式;教学考核基金项目:扬州大学教改课题(Y ZU JX 2020—C16)。
★通信作者事业的重要手段,深入挖掘各类课程的思政资源,强化学生的思想政治水平,增强当代大学生的获得感,为中国特色社会主义事业源源不断培养合格建设者和可靠接班人,而避免培养出具备专业能力而缺乏思想政治素养的学生。
不同的专业课具有不同的特点,有不同授课体系,要寻找专业课与思政课的协同点,才能推动推动专业课与思政课的协同育人发展。
在动物传染病的课程中,有许多历史典故、名人轶事,现实案例,将传染病的相关知识与历史、名人典故相结合,能够激发学生的学习兴趣和热情,加深了学生对专业知识的理解,提高了学生的文化素养。
分子生物学 分子生物学研究法
5‘ 供者
探针
3‘ 受者
Taqman法 分子信标(molecular beacon)法
高效液相色谱 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法 DNA芯片技术（DNA chip）
SNP数据库
国立生物技术信息中心 德国的HGBAS网站
JST的数据库
2.5基因打靶(gene targeting)
通过DNA定点同源重组，改变基因组中 的某一特定基因，在生物活体内研究该 基因的功能。(反向遗传学)
抗原－抗体 特异性结合
SDS-PAGE 后转膜
基因表达产 物――蛋白
的检测
ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDSPAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。
Southern blot
Northern blot
Western blot
双脱氧法测序
gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行 到与DNA变性温度一致的凝胶位置时， DNA发生部分解链，电泳迁移率下降， DNA链中有一个碱基改变时，会在不同 的时间发生解链，因影响电泳速度变化 的程度而被分离。
荧光共振能量传递 (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
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•5.2 常见的DNA操作技术
常用的转化方法：
§ 化学转化（CaCl2）法 § 电击法
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•5.2 常见的DNA操作技术
化学转化原理：
在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。
出每微克的转化菌落数）
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•5.2 常见的DNA操作技术
5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）技术
§ 1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快 速扩增特定基因DNA序列的方法
§ 原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩 增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引 物，经过变性，退火和延伸若干个循环后， DNA扩增倍数可达2n 倍
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•5.2 常见的DNA操作技术
反应体系
§ 模板DNA：待扩增的目的片段 § 特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序
列互补的寡核苷酸片段，15-30bp § DNA聚合酶 § dNTP § 含有Mg2+的缓冲液
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.3重组DNA技术的概念
▪ 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁 殖，以获得该DNA的大量拷贝。
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•5.1 重组DNA技术发展史
•2、重组DNA技术的基本步骤
▪ ①目的基因的获得与载体的制备 ▪ ②目的基因与载体DNA的连接 ▪ ③重组DNA分子导入受体细胞 ▪ ④重组体的筛选与重组DNA的鉴定 ▪ ⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化
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▪ 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。
▪ 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应
四环素、链霉素等 § -互补蓝白斑筛选 § 营养条件（自养、异养）
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•5.2 常见的DNA操作技术
-互补筛选
§ β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基
端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒 § 编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的
从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸
切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团
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•5.1、 重组DNA技术发展史
•限制性核酸内切酶
•限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
•一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核 酸水解酶
•将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状
•转导？ 转染？
•感受态细胞（Competent cells） ： •受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化 学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变 化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于 这种状态下的细胞称~
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•5.2 常见的DNA操作技术
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•5.2 常见的DNA操作技术
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•P153
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•5.2 常见的DNA操作技术
电击转化：
•Bam HⅠ
•GGATC
C •GCCTAG
••GCCTAG•+••GATCGC
•分类:
•Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
•（基因工程技术中常用Ⅱ型）
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•5.1 重组DNA技术发展史
•命名
•Hin dⅢ •Haemophilus influenzae d株
•流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•属 系 株 序
•
•
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第一个字母取自产生该酶的细菌属名， 用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用 小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 扬州大学《现代分子生物学》5分子
生物学研究方法
•5.1 重组DNA技术发展史
•Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
和鉴定； ▪ 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一
酶切位点，称为多克隆位点； ▪ 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
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•5.1 重组DNA技术发展史
§ 噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12 个核苷酸5′端突出粘性末端
•筛选
•表型筛选
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•酶切电泳鉴定
•菌落原位杂交
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.5重组DNA技术的意义
▪ 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 ▪ 重组DNA技术缩短了进化时间 ▪ 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 ▪ 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，
•表达载体(expression vector) • 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。
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•5.1 重组DNA技术发展史
•载体的选择标准
▪ 能自主复制； ▪ 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选
••GCATGC•+••GCTAGC •平端切口
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••GCCTA•+••GATCGC G •粘端切口
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•5.1 重组DNA技术发展史
▪ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。
▪ T4¯DNA连接酶 ▪ EcoR I 连接酶 ▪ T7¯DNA连接酶
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•5.1 重组DNA技术发展史
目的基因的来源
§ 原
•天然DNA
•（染色体DNA、病 毒DNA(噬菌体DNA)、 质粒DNA、线粒体 DNA和叶绿体DNA）
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从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶类 限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ
反转录酶
多核苷酸激酶 末端转移酶 DNA外切酶Ⅲ λ噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基
▪ 1、DNA分子的切割与连接技术
▪ 限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学 家有了进行DNA操作的基本工具。
▪ 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立
Байду номын сангаас
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•5.2 常见的DNA操作技术
蓝白斑
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•5.2 常见的DNA操作技术
转化率的计算：
§ 转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂 板菌液体积）
§ 插入频率＝白色菌落数/蓝色菌落数+白色菌落数 § 转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算
使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
•菌液：生长对数期 •场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm
• 温度：0-4℃
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•5.2 常见的DNA操作技术
克隆的筛选：
§ 抗生素基因。 § 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、
•即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排 列呈回文对称的序列。
•GGATC C •GCCTAG
•切口 ：平端切口、粘端切口
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•5.1 重组DNA技术发展史
•HindⅡ
•GTCGAC •CAGCTG
•Bam HⅠ
•GGATCC •CCTAGG
•λ噬菌体
▪ 黏粒、YAC、BAC ：高容量载体
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•5.1 重组DNA技术发展史