5分子生物学研究法——DNA、RNA及蛋...
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物精选全文
可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。
本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。
5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。
事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。
因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。
第 8 讲 DNA RNA 蛋白质操作技术(1)
23
24
25
26
DNA连接酶： DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用
T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘 性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 （二）来源－噬菌体T4感染E. coli分离的一种单链多 肽酶、MW.68KD。 （三）催化反应：
只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之 象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
3. 将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠 （同正常一样），最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
胚胎细胞克隆: 体细胞克隆
12
13
在这个过程中： 1.“基因剪刀” DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
掌握
1. 几种抗生素的英文缩写 2. 多克隆位点的概念 3. 大肠杆菌蓝白斑筛选原理 4. 普通PCR的扩增原理和过程
93
Thank you!
94
水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 可以阻止四环素进入细胞。 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之
失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活
（5）hygr
潮霉素β磷酸转移酶 使潮霉素β失活。
33
3. 多 克 隆 位 点 （ multiple cloining site，MCS）
①拷贝数多，10-200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，其拷贝数猛增 至 1000-3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学的基本原理与方法
分子生物学的基本原理与方法分子生物学是研究生物分子结构、功能和相互作用的学科，是现代生物学的重要分支。
本文将介绍分子生物学的基本原理和常用的实验方法。
一、分子生物学的基本原理分子生物学的基本原理是基于遗传物质DNA的复制、转录和翻译过程。
DNA是生物体内的遗传物质，它携带了生物个体的遗传信息。
DNA的复制是指DNA分子通过自我复制过程，使得每个新合成的DNA分子与原始DNA分子具有相同的遗传信息。
转录是指DNA通过酶的作用，产生RNA分子的过程。
转录产生的RNA可以是信使RNA （mRNA）、转运RNA（tRNA）或核糖体RNA（rRNA），这些RNA 分子在翻译过程中发挥重要的作用。
翻译是指RNA分子通过核糖体的作用，将RNA上的密码子翻译成氨基酸序列，合成蛋白质。
分子生物学的基本原理还包括基因的表达调控机制。
基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生蛋白质的过程。
在这个过程中，细胞内的信号分子会识别和结合到基因的启动子区域，调控基因的转录水平。
转录因子是一种可以结合到启动子区域的蛋白质，它们可以促进或抑制基因的转录过程。
此外，还有一些表观遗传学的机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰等，也参与了基因的表达调控。
二、分子生物学的基本方法1. DNA提取：DNA提取是从生物体组织或细胞中分离纯化DNA的过程。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和柱层析法等。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于增加DNA片段数量的方法，它可以在体外通过模拟DNA复制过程，快速地合成大量特定DNA序列。
PCR可以应用于基因检测、DNA序列扩增和基因克隆等领域。
3. 凝胶电泳：凝胶电泳是分子生物学中常用的实验方法，可以将DNA、RNA或蛋白质根据其大小和电荷迁移率分离。
通过观察样品在凝胶上的迁移情况，可以判断目标分子的大小和纯度。
4. 蛋白质表达与纯化：蛋白质表达与纯化是分子生物学中用于获得特定蛋白质的方法。
分子生物学前沿(一)2024
分子生物学前沿（一）引言概述：分子生物学是研究生物体内生物大分子如DNA、RNA和蛋白质以及其相互作用的学科领域。
近年来，随着技术的不断进步和新的研究方法的出现，分子生物学进入了一个前所未有的前沿阶段。
本文将探讨分子生物学的五个前沿领域，包括基因组编辑、表观遗传学、蛋白质组学、CRISPR技术以及单细胞测序。
一、基因组编辑1. CRISPR-Cas9系统的原理和应用2. TALEN和ZFN技术的优势与局限性3. 基因编辑在疾病治疗中的潜力4. 基因修饰在农业领域的应用5. 基因组编辑的道德和伦理问题二、表观遗传学1. DNA甲基化和染色质重塑2. 表观遗传修饰对基因表达的调控3. 表观遗传学在疾病治疗中的作用4. 可逆性表观遗传变化的研究进展5. 表观遗传学与环境因素的关联研究三、蛋白质组学1. 蛋白质组学的研究方法和技术2. 大规模蛋白质互作网络的构建与分析3. 蛋白质定量与定位的新方法4. 蛋白质组学在疾病研究中的应用5. 蛋白质药物研发的新进展四、CRISPR技术1. CRISPR在基因治疗中的应用2. CRISPR用于疾病模型建立的优势3. CRISPR修饰哺乳动物基因组的技术挑战4. CRISPR技术的新进展和改进5. CRISPR应用的道德和安全性问题五、单细胞测序1. 单细胞测序技术的原理和方法2. 单细胞测序在发育生物学中的应用3. 单细胞测序揭示人体组织和器官的异质性4. 单细胞测序在肿瘤研究中的突破5. 单细胞测序的数据分析方法和挑战总结：分子生物学在基因组编辑、表观遗传学、蛋白质组学、CRISPR 技术以及单细胞测序等前沿领域取得了重要突破。
这些研究对于理解生命的基本机制、疾病的发生发展以及药物研发具有重要意义。
然而，这些领域仍面临着许多挑战，包括伦理道德问题、技术和方法的改进以及数据分析的挑战等。
随着进一步的研究和发展，分子生物学前沿领域将不断拓展我们对生物的认识和应用。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
简述分子生物学的主要研究内容
简述分子生物学的主要研究内容分子生物学是研究生物体内生命活动的基础单位——生物分子的结构、功能和相互关系的学科。
其主要研究内容包括以下几个方面：1. DNA 的结构和功能：分子生物学研究DNA 的双螺旋结构、碱基序列以及 DNA 的复制、修复、重组等功能。
此外，还研究 DNA 的转录为 RNA 的过程，进一步揭示基因的表达和调控机制。
2. RNA 的结构和功能：分子生物学研究各种 RNA 分子的结构、合成与分解、调控以及功能，例如信使 RNA (mRNA)、转运RNA (tRNA)、核糖体 RNA (rRNA) 等，以及其他非编码 RNA 的功能。
3. 蛋白质的合成和调控：分子生物学研究蛋白质的合成、折叠、修饰和降解等过程，同时也研究蛋白质的结构和功能。
此外，还研究基因表达调控中的转录因子、启动子、细胞信号转导等分子机制。
4. 基因工程和基因治疗：分子生物学在基因工程和基因治疗领域有重要应用。
基因工程利用分子生物学技术修改和调控基因，创造出具有特殊功能的生物体或蛋白质。
基因治疗是利用DNA 或RNA 分子为基础，将健康基因导入到疾病患者体内，以修复或替代异常基因。
5. 分子进化与系统生物学：分子生物学通过比较生物体内分子的序列或结构，揭示物种之间的进化关系和生物进化机制。
此外，还应用分子生物学技术研究生物多样性、系统分类学和物种分化。
6. 生物信息学：随着大规模基因组测序技术的发展，分子生物学与信息学的交叉研究逐渐成为一个新兴领域。
生物信息学的研究内容包括基因组学、蛋白质组学、转录组学和表观基因组学等，主要应用于基因组序列分析、生物序列比较、蛋白质结构预测和表达调控网络研究等方面。
总之，分子生物学的主要研究内容可以总结为 DNA、RNA 和蛋白质的结构、功能和相互关系，以及与之相关的基因表达调控、基因工程、基因治疗、分子进化和生物信息学等方面的研究。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系
前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后 产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。
Plac MCS lacZ’
pUC18/19
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷
X-gal
b
a b-半乳糖苷酶的a-肽段
CH2OH
HO
O
OHH H
O
H
H
H OH
Cl Br
N
Cl O Br
N
N
Br Cl
5、pGEM-3Z质粒
长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ' 基因。
Pst I
Hind III
第二部分来源于pSC101质粒的四
BamH I
环素抗性基因（tetr）；
Pvu I
第三部分则来源于ColE1的派生质
Pst I
Apr
Tcr
pBR322
粒pMB1的DNA复制起点（ori）。
Sal I 优点是具有较小的分子量(4363bp)， 易于纯化。即使携带了6-8kb的外
含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白 色。
pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码 的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体 转化子的鉴定。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoR I 和BamH I）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。
含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的附着提 供了特异性识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的 外源基因便会转录出相应的mRNA。
6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）
由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种 不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制 的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝，从带有该质 粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。
2、ColE1质粒载体
松弛型复制控制的多拷贝质粒。
一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入 氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细 胞的生长也随之停止。
RNAI在RNAII的5’末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后 者相互作用，阻止RNaseH加工RNAII，使其不能转化为有活性的引 物，阻碍复制起始。
没有Rop蛋白，RNAI基因就不能起始转录。
源的部分组成的：
EcoR I Cla I
第一部分来源于pSF2124质粒易位 子Tn3的氨苄青霉素抗性基因 （AmpR）；
4363 bp
源DNA片段，操作仍较便利。 有两种抗生素抗性基因作为转化子
ROI ROP
Bal I
的选择标记。
有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，
每个细胞可累积1000~3000个拷贝，
Origin of Replication Hind II
便于制备重组体DNA。
4、pUC质粒载体（包括四个部分）：
事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于 新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其 它生命科学技术的根本特征。
5.1 基因操作的基本工具
（一）限制性核酸内切酶
能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoR I是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识
LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽，IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的β-半乳糖苷酶α-肽 与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳 糖苷酶，水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）， 生成蓝色的溴氯吲哚。
这类质粒载体可保证外源DNA序列在不同物种(原核和真核) 的细胞间得到扩增，用途广泛。
7、pBluescript噬菌粒载体
pBluescript是一类从pUC载体派生 而来的噬菌粒载体，简称为pBS （+/-），如今则更多地叫作 pBluescript KS（+/-）或 pBluescript SK（+/-）。
来自pBR322质粒的复制起点（ori）
氨苄青霉素抗性基因（ampr）
大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）启动子及编码α-肽链的DNA序 列。特称为lacZ’基因
位于lacZ’基因5’-端的一段多克隆位点（MCS），外源基因插入破 坏lacZ ’基因功能
优点：
更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体 时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点， 其分子小了许 多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质 粒不经氯霉素扩增时， 平均每个细胞即可达500~700个拷贝。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核 酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩 增等，是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载 体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类 分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了 外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表 达。
别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的 小片段。
重组DNA实验中常见的主要工具 酶
（二）基因克隆的载体
载体三要素：
自我复制能力 携带外源基因片段大小 插入位点多少
大肠杆菌质粒载体：
1、pSC101质粒载体
长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoR I、Hind III、 BamH I、Sal I、Xho I、Pvu II以及Sma I等7种限制性核酸内切 酶的单酶切位点，在Hind III、BamH I和SalI等3个位点插入外 源基因，会导致tetr失活。