质粒提取注意事项
质粒提取实验注意事项
质粒提取实验注意事项质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，它能够从细菌中提取目标质粒，用于后续的转染、定量PCR、序列测定等实验。
质粒提取实验虽然操作简单，但是仍然需要遵循一定的注意事项，才能确保实验的顺利进行和结果的准确性。
下面将介绍质粒提取实验的注意事项。
1. 实验前的准备工作：在进行质粒提取实验之前，首先要做好实验室的准备工作。
要确保实验室中的工作台、仪器和试剂瓶都是干净整洁的，避免污染影响实验结果。
另外，要准备好所需的耗材和试剂，如离心管、离心管架、洗涤缓冲液、溶解缓冲液等。
并根据实验计划，提前准备好质粒所在的宿主菌培养液，提取缓冲液等相关材料。
2. 操作过程中的注意事项：在进行质粒提取实验的操作过程中，需要严格遵守操作规程，确保实验操作的准确性和稳定性。
在进行菌培养和离心等步骤时，要避免振荡或剧烈振动，以免对菌体和质粒的完整性产生影响。
另外，在使用洗涤缓冲液、溶解缓冲液和纯化缓冲液时，要注意溶液的pH值和温度是否符合要求，以及是否在有效期内。
同时要注意防止留下DNA和蛋白质残留，避免污染影响后续实验。
3. 质粒提取后的保存和处理：在完成质粒提取实验后，提取得到的质粒需进行适当的保存和处理。
一般情况下，提取得到的质粒可以用无菌的ddH2O或TE缓冲液溶解后，分装成适量的小份，然后在-20或更低的温度下保存。
另外要注意标记好每份提取得到的质粒，以免混淆。
在进行保存和后续实验过程中，要避免频繁的冻融，以免对质粒的完整性产生影响。
4. 实验后的清洁和记录工作：在完成质粒提取实验后，要及时清理实验台和操作工具，保持实验室的整洁。
同时要详细记录实验过程中的操作步骤、使用的试剂和仪器，以及实验结果等相关信息。
这些记录对于实验结果的分析和后续实验的开展都是十分重要的。
总之，质粒提取实验是一项重要的实验技术，在进行实验时需要严格遵循操作规程，注意操作细节，确保实验结果的准确性和可靠性。
希本通过本文介绍的注意事项，能够帮助实验人员顺利进行质粒提取实验，并获得高质量的实验数据。
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项质粒小提是一种常用的实验方法，用于从细菌中提取质粒DNA。
其原理和提取过程中有一些注意事项，下面是详细介绍。
质粒小提的原理：质粒小提的原理是利用离心法将大量细菌聚集在一起，然后使用碱解液溶解细菌细胞壁和膜，将质粒DNA释放到溶液中。
接下来，通过加入特定的盐和有机溶剂，将质粒DNA与其他细胞成分分离开来。
最后，通过离心将质粒DNA沉淀下来，即完成了质粒小提。
质粒小提的提取过程中的注意事项：1.使用无菌操作：在整个提取过程中，确保使用无菌操作，以防止外源性DNA的污染。
使用无菌平台和器具，并且在实验室操作台上清洁表面。
2.选择适当的细菌培养基：选择适当的培养基和条件来培养细菌，以获得最佳的质粒DNA产量。
选择含有适当选择抗生素的培养基，以确保只有含有目标质粒的细菌生长。
3.对细菌进行预处理：在提取过程之前，对细菌进行适当的预处理是很重要的。
通常，细菌应该处于对质粒DNA产生最佳条件的生长阶段。
此外，使用良好的细菌培养方法，以确保质粒DNA在细菌中的稳定和延长拷贝数。
4.合理选择裂解液：选择适当的裂解液可以有效地裂解细菌细胞壁和膜，释放质粒DNA。
常用的裂解液包括碱、酶和界面活性剂。
根据不同的细菌类型和质粒特性，选择合适的裂解液方法。
5.应用适当的离心条件：离心是质粒小提过程中一个非常重要的步骤，可以将质粒DNA与其他组分分离开来。
确定适当的离心速度和离心时间，以确保质粒DNA能够沉淀下来，并且去除其他细胞残留物。
6.保存提取的质粒DNA：提取到的质粒DNA需要正确保存，以避免降解和污染。
使用无菌的保存管和适当的缓冲液，如TE缓冲液，在低温（通常-20°C）下保存质粒DNA。
以上是质粒小提的原理和提取过程中的注意事项的详细介绍。
在操作过程中要严格控制操作条件，以获得高质量的质粒DNA。
酵母质粒的提取注意事项
酵母质粒的提取注意事项1. 实验前准备在进行酵母质粒提取实验之前，需要准备好所需材料和试剂。
常用的材料包括酵母培养物、细胞裂解液、酶切酶、离心管、离心机等。
试剂方面，需要注意购买高质量的试剂，并按照说明书的要求保存和使用。
2. 细胞培养与处理在进行酵母质粒提取实验之前，需要进行酵母菌的培养和处理。
首先，将酵母菌接种到含有所需培养基的琼脂糖平板上，培养一夜，然后挑取单个菌落转移到液体培养基中，继续培养至所需菌量。
此外，在进行酵母菌细胞处理时，需要注意细胞浓度的控制，避免浓度过高或过低对实验结果产生影响。
3. 细胞裂解与质粒提取酵母菌细胞裂解是酵母质粒提取的重要步骤。
一般情况下，细胞裂解可通过化学方法、机械方法或酶解方法实现。
其中，酶解方法常用于酵母菌质粒提取，具有操作简单、效果较好的特点。
在进行细胞裂解时，需要注意裂解液的选择和浓度，以及裂解时间和温度的控制，以确保细胞完全裂解，质粒DNA充分释放。
4. 质粒DNA纯化与保存在进行质粒提取后，需要对提取得到的质粒DNA进行纯化和保存。
纯化可以通过酚/氯仿法、硅胶柱纯化法或商用质粒纯化试剂盒等方法实现。
在选择纯化方法时，需要根据实验要求和样品特点进行选择，并根据说明书的要求进行操作。
纯化后的质粒DNA应及时保存，可以用TE缓冲液稀释保存在-20°C或-80°C的冰箱中，以避免质粒DNA的降解和损失。
5. 实验操作注意事项在进行酵母质粒提取实验时，还需要注意以下几点操作事项：- 实验室操作要严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性DNA的污染。
- 实验过程中注意个人防护，佩戴手套、口罩和实验服，避免实验中的化学品对身体造成伤害。
- 实验前应仔细阅读所用试剂的说明书，了解其性质和使用方法，按照要求准确称取和调配试剂。
- 实验中的离心操作要注意离心管的放置位置和离心速度的选择，以避免样品的溢出和离心管的破裂。
- 实验后要及时清洗实验台面和相关器材，保持实验环境的整洁和无菌。
碱裂解法提取质粒dna的注意事项
碱裂解法提取质粒DNA注意事项1. 安全注意事项：•使用个人防护装备，如实验室外套、手套和护目镜，以防止对碱性溶液的不慎接触。
•碱性溶液可能对皮肤和眼睛有刺激性，因此在操作过程中要小心谨慎。
2. 试剂准备：•确保所使用的试剂是新鲜的，并按照制造商的建议来保存和使用。
•使用经过蒸馏水或去离子水处理的试剂，以避免引入可能影响实验结果的杂质。
3. 菌落培养：•使用含有所需质粒的细菌菌株进行培养。
确保选择的细菌株含有你感兴趣的质粒。
•遵循适当的培养条件，包括温度、培养时间和培养介质。
4. 收获菌体：•选择适当的时间点进行菌体的收获，通常在菌液达到对数生长期时。
这可以确保有足够的质粒在菌体内。
5. 菌体收集：•使用合适的离心机和离心管来收集大量的菌体，以确保后续实验有足够的起始材料。
6. 碱裂解过程：•严格按照碱裂解的步骤进行操作，避免操作时间过长或者过短。
•控制碱性溶液的浓度和温度，以确保有效地裂解菌体膜。
7. 中和步骤：•在裂解之后，使用酸性缓冲液迅速中和碱性溶液，以避免对DNA的影响。
8. 离心步骤：•在离心过程中，确保对细胞碎片和残留物进行彻底的去除，以获得清晰的上清液。
9. 质粒DNA保存：•将提取得到的质粒DNA保存在适当的条件下，通常是在-20°C或更低的温度下，以防止DNA降解。
10. 检测纯度和浓度：•在实验结束后，使用比色法、凝胶电泳或其他方法检测提取的质粒DNA的纯度和浓度。
11. 设定菌体培养条件：确保细菌在培养过程中处于对质粒复制有利的状态。
合理的培养条件，包括温度、培养介质和时间，能够影响细菌的生长和质粒的复制。
12. RNA酶的适当使用：在碱裂解步骤中，RNase A通常用于去除RNA。
确保RNase A的浓度足够，同时避免过高的浓度，以免对DNA产生不利影响。
可以在提取缓冲液中加入合适浓度的RNase A。
13. 质粒大小的考虑：对于大质粒的提取，可能需要更加彻底的碱裂解步骤，或者使用更高浓度的碱性溶液。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法 -回复
大肠杆菌质粒提取碱裂解法-回复大肠杆菌质粒提取是一种常用的实验技术，可以用于分离和纯化重组DNA 质粒。
碱裂解法是其中一种常用的技术，本文将详细介绍大肠杆菌质粒提取碱裂解法的步骤和相关注意事项。
一、材料准备1. 大肠杆菌含质粒的培养物：可以选择含有目标质粒的大肠杆菌菌株。
例如，适用于蓝/白哺乳素筛选的菌株如DH5α。
2. 质粒纯化试剂盒：选择适合自己实验的质粒纯化试剂盒，可以根据需要选择小或大规模的提取试剂盒。
3. 离心管和离心机：用于离心大肠杆菌培养物和纯化DNA溶液。
4. 碱裂解缓冲液：可以通过自制或直接购买管制的缓冲液，如1 MTris-HCl (pH 8.0)、0.5 M EDTA (pH 8.0) 和10 SDS。
二、菌群扩增和收获菌株1. 从培养物中收取大肠杆菌：从10 mL 大肠杆菌培养物中取出适量菌液，可通过离心和倾倒上清液的方式收集菌块。
2. 重悬菌液：用无菌的PBS缓冲液洗涤菌块，再用10 mL 新鲜PBS缓冲液将菌块重悬。
3. 破碎细胞：将重悬的菌液转移至一个离心管中，对菌液进行破碎。
可以通过加入Lysozyme (100 mg/mL)、RNase A (10 mg/mL) 和TritonX-100 (1)来实现。
然后进行轻轻的颠倒以混合试剂。
4. 加入碱裂解缓冲液：向破碎的细胞中加入适量的碱裂解缓冲液。
一般来说，每个培养物使用5 mL缓冲液进行处理。
5. 匀浆与悬浮：用高速离心机对混合液进行离心，以沉淀细胞碎片。
然后将上清液转移到另一个离心管中，进行均匀悬浮。
三、纯化DNA1. 加入异丙醇：向菌液中加入等体积的异丙醇。
使用移液器将试剂静态混合。
2. DNA沉淀：将混合液高速离心，将沉淀的DNA从上清中分离出来。
沉淀的细胞碎片在离心管底部形成一个白色团块，而上清液大部分为透明的液体。
3. 洗涤：使用95 乙醇洗涤DNA沉淀物。
将95 乙醇分别加入到离心管中，并将其高速离心10分钟。
质粒提取注意事项
1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。
用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
质粒提取溶液123的作用
质粒提取溶液123的作用质粒提取溶液123是一种常用的实验试剂，用于从细菌中提取质粒。
质粒是细菌中的一种环状DNA分子，质粒提取溶液123的作用是通过一系列化学和物理方法，将质粒从细菌细胞中分离出来，以便进一步进行质粒的研究和应用。
质粒提取溶液123的主要成分是盐酸、EDTA和蛋白酶K等。
盐酸起到调节溶液酸碱度的作用，使其适合质粒提取的过程。
EDTA是一种螯合剂，能够与金属离子结合，防止金属离子的存在对质粒提取的影响。
蛋白酶K是一种蛋白酶，能够降解细菌细胞中的蛋白质，使质粒能够被有效地提取出来。
在使用质粒提取溶液123进行质粒提取的过程中，首先需要将细菌细胞收集起来，并在适当的条件下进行裂解。
细菌细胞裂解后，质粒与其他细胞组分分离，形成混合物。
接下来，将质粒提取溶液123加入混合物中，通过离心等操作，将质粒从其他细胞组分中分离出来。
最后，经过一系列的洗涤和纯化步骤，得到纯净的质粒溶液。
质粒提取溶液123在科研领域有着广泛的应用。
首先，质粒提取溶液123可以用于基因工程研究中。
通过提取细菌中的质粒，可以获得含有特定基因的质粒，进而进行基因克隆、基因表达等研究。
其次，质粒提取溶液123也可以用于制备质粒文库。
质粒文库是一种保存了大量质粒的库，可以用于筛选特定基因或进行基因测序等研究。
此外，质粒提取溶液123还可用于质粒测序、质粒转染等实验。
然而，质粒提取溶液123的使用也存在一些注意事项。
首先，在使用过程中需要严格遵守实验操作规范，避免对人体和环境造成伤害。
其次，使用质粒提取溶液123时需要注意浓度的选择，以及合适的操作温度和时间。
此外，质粒提取溶液123在保存和运输过程中需要避免高温和阳光直射，以防止溶液的变质和降解。
总的来说，质粒提取溶液123是一种常用的实验试剂，具有分离提取质粒的作用。
它在基因工程研究、质粒文库制备等领域有着广泛的应用。
然而，在使用质粒提取溶液123时需要注意实验操作规范，并严格遵守使用要求。
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1. 质粒制备的基本原理是什么？
答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。
所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。
制备质粒最常用的方式是碱裂解法。
质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。
SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。
如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。
我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。
2. 质粒DNA 制备的关键是什么？
答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。
质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。
这些变性质粒，不能酶切。
所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。
3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？
答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。
如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。
要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。
4. 如何确定质粒小抽细胞的用量？
答：根据实验目的确定质粒的需求量。
对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。
质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。
高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。
使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。
对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。
5. 电泳分析抽提的质粒会看到什么？
答：如果您制备的质粒很脏，从电泳加样孔起，您会看依次看到微量的基因组DNA, 开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒（denatured supercoiled plasmid）, 细菌RNA。
判定质粒制备质量高低的标准是观察超螺旋质粒在整个抽提DNA中的百分比。
质量高的主要部分为超螺旋质粒，没有变性超螺旋质粒和没有基因
组，没有RNA污染。
6. 质粒制备的得率是由哪些因素决定的？
答：由细胞拷贝数，细胞的用量，属主细胞类型和和纯化方式。
7.您的质粒需要什么样的纯度？
答：根据您的实验目的确定您需要的纯度。
对于一般的克隆分析鉴定，用手工和试剂盒制备的DNA都能达到要求。
测序需要将质粒中的非核酸类杂质和RNA的水平控制在非常低的水平。
基因组的存在对测序影响不大。
开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒的测序效果基本相似。
转染细胞纯度较高，用于基因治疗的最高，需要无热源，无内毒素（LPS）。
8. 为什么酶切鉴定“有插入片段”的质粒测序却发现是空的？
答：这种现象测序经常会发现，有些用户怀疑是我们搞错了。
请相信，测序不可能将您的片段搞丢，测序结果是硬指标。
产生这种现象的直接原因是质粒制备过程中产生了变性的超螺旋质粒，它无法被限制性内切酶酶切；而正常的超螺旋质粒，酶切后变成线性分子，迁移率变小，酶切后变性与正常超螺旋质粒之间的距离加大。
变性的超螺旋质粒和正常的超螺旋质粒在酶切前靠得比较近，常被忽略。
电泳分析酶切效果时，变性的超螺旋质粒常常被误认为是酶切下来的片段，导致误判。
其实要判定这种假象非常容易，只要在酶切电泳分析时，增加不做酶切的对照就可以了。
9. 如何判定DNA 的纯度和浓度？
答：对于采用试剂盒抽提的DNA, 测定OD260和OD280浓度，OD260/OD280一般在1.7-1.8之间。
1 OD260 = 50 μg/ml。
需要注意的是，用简单手工抽提的DNA，OD260/OD280没有多大意义，由于含有水解的核酸小片段，该比值偏高。
需要通过琼脂糖电泳来估计浓度。
10.为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解？如何解决？
答：有人将问题的责任推到试剂盒的生产商，冤枉了。
产生此的原因有很多，主要原因是核酸酶的污染。
除了制备过程外源带入核酸酶外，但是根据有关报道发现，质粒属主细胞的种类会影响抽提核酸的质量。
理想的用于抽提高质量质粒的细胞有DH5alpha, DH1, C600, XL1-Blue；HB101, JM系列细胞内含丰富的核酸酶活性，如果您制备的质粒准备长期保存，请换属主细胞。
11. 为什么小抽可以，一放大就不行了？
答：此种情况经常会发生，常使研究人员感到很困惑。
原因主要出在大规模制备时细胞接种量和方式有问题，细胞裂解时溶液的用量和处理时间把握不准所致。
大规模细胞培养正确的
方式是从新鲜培养板上挑单克隆接种到2-5ml含合适抗菌素的培养基中，培养到对数期（8小时左右）；放大培养时需要将种子稀释500-1000倍继续培养12-16小时（通常是过夜培养）。
摇瓶培养，摇瓶所接的培养基不要超过摇瓶总体积的25%。
转速达到250转/分。
收集细胞没有什么讲究，采用的速度能将细胞沉下来就可以了。
速度过高，细胞悬浮比较困难。
大规模碱法制备需要选用合适的细胞用量，一般原则是细胞宁少勿多，溶液宁多勿少，变性时间宁短勿长。
大规模制备采用的裂解溶液与细胞重量的比例小于小抽，细胞的裂解效果成为得率和纯度高低的关键。
如果裂解不完全或采用的细胞过多，很多质粒不能充分的释放出来，有些释放出来的质粒也会滞留在各种沉淀物之间无法回收。
NaOH-SDS (Solution II)变性过程是关键，溶液加入后通过上下颠倒小心混匀，如果发现细胞很难变澄清，表明溶液少了，整个变性过程应控制在5-10分钟，如果条件许可，预冷所有溶液。
加入合适量的中和液(Solution III)要上下颠倒小心混匀数次，让抽提物真正做到中和，使基因组DNA，蛋白质，细胞碎片充分的沉淀下来，才能保证后续可以得到高纯度的质粒。
还有一点需要强调是，接种的克隆新鲜十分关键。
甘油菌，4度保存的菌液，时间很长的划板或转化板，都不是理想的种子。
如果没有做过传代实验，不要直接采用甘油菌接种做大抽。