质粒DNA的提取和PCR技术
质粒扩增的步骤
质粒扩增的步骤一、引言质粒扩增是分子生物学中常用的一种技术方法，用于在细菌中扩增质粒DNA。
通过质粒扩增，可以获得大量的目标DNA，用于进一步的实验或应用。
本文将介绍质粒扩增的步骤。
二、质粒提取质粒提取是质粒扩增的第一步。
首先，需要选择适当的细菌菌株，如大肠杆菌。
然后，将含有目标质粒的细菌培养物进行离心，将菌体沉淀下来。
接下来，使用质粒提取试剂盒等方法，提取出质粒DNA。
三、限制酶切限制酶切是质粒扩增的关键步骤之一。
通过限制酶的作用，可以将质粒DNA切割成特定的片段。
首先，选择适当的限制酶，根据目标片段的大小和限制酶的切割位点来确定。
然后，在适当的条件下，将质粒DNA与限制酶一起反应。
反应后，通过琼脂糖凝胶电泳，可以确定限制酶切割后的DNA片段大小。
四、连接反应连接反应是质粒扩增的下一步。
通过连接反应，可以将目标DNA片段连接到载体DNA上，形成重组质粒。
首先，选择适当的连接酶，如T4 DNA连接酶。
然后，在适当的条件下，将目标DNA片段与载体DNA和连接酶一起反应。
反应后，通过琼脂糖凝胶电泳，可以确定连接反应的效果。
五、转化转化是质粒扩增的关键步骤之一。
通过转化，将重组质粒导入细菌中。
首先，选择适当的细菌菌株，如大肠杆菌。
然后，将重组质粒与细菌进行共培养，使其发生转化。
转化后，通过在含有适当抗生素的培养基上进行筛选，可以获得含有目标质粒的细菌克隆。
六、扩增扩增是质粒扩增的最后一步。
通过扩增，可以获得大量的目标质粒。
首先，选择合适的引物，设计扩增反应体系。
然后，在适当的条件下，进行PCR反应，扩增目标质粒的DNA序列。
扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳，可以确定扩增反应的效果。
七、总结质粒扩增是一种常用的分子生物学技术，用于在细菌中扩增质粒DNA。
本文介绍了质粒扩增的步骤，包括质粒提取、限制酶切、连接反应、转化和扩增。
通过这些步骤，可以获得大量的目标质粒，用于进一步的实验和应用。
质粒扩增技术的应用范围广泛，对于分子生物学研究和基因工程等领域具有重要意义。
提取质粒dna的方法
提取质粒dna的方法提取质粒DNA的方法是一种从生物样品中提取DNA的方法，用于分析基因组学、遗传学或其他基因相关的研究。
它是所有DNA技术的基础。
提取质粒DNA的方法主要包括三个步骤：破解细胞壁、提取DNA片段和提取DNA片段。
第一步，破解细胞壁。
为了提取细胞内的DNA，必须先破坏细胞壁。
这一步可以通过使用植物激素、酶和其他破坏细胞壁的物质来完成。
第二步，提取DNA片段。
在破坏细胞壁之后，生物样品中的DNA就可以从细胞内被提取出来。
这一步通常是将样品加入一定的溶液，如洗涤溶液，然后用放大器去提取DNA片段。
第三步，提取DNA片段。
在提取DNA片段之后，必须对其进行纯化处理，以便提取的DNA片段不会受到其他物质的干扰。
一般情况下，这一步是通过使用离心机将DNA 片段从溶液中分离出来，然后用水冲洗去除其他物质，最后得到纯净的DNA片段。
提取质粒DNA的方法也可以用来提取植物细胞内的DNA。
与提取动物细胞中的DNA不同，植物细胞内的DNA要更加困难，因为植物细胞周围可能有多层细胞壁，而这些细胞壁很难被破坏。
因此，植物细胞内的DNA提取一般都是采用化学方法，即使用碱性有机溶液，以破坏细胞壁，然后再用放大器提取DNA片段。
此外，还有一些无细胞DNA提取的方法，如PCR法、小RNA测序、质粒提取等。
PCR法是用来检测和检验DNA的一种技术，可以扩增微量DNA，从而获取充足的DNA材料进行检测。
小RNA测序是一种新型的基因测序技术，可以检测植物和动物体内特定的RNA，检测特定靶基因的表达。
最后，质粒提取是一种从生物样品中提取DNA质粒的技术，可以用于分子生物学研究，如基因克隆、DNA测序等。
总之，提取质粒DNA的方法是一种常用的DNA提取技术，也是所有DNA技术的基础。
它可以用于从动物和植物样品中提取DNA片段，以及从无细胞DNA中提取DNA质粒，以用于各种基因组学、遗传学和分子生物学研究。
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
质粒dna的提取
质粒DNA的提取1. 引言质粒DNA提取是在分子生物学研究中常用的实验操作之一。
质粒是一类圆环状的DNA分子，存在于原核生物中。
质粒DNA提取的目的是为了获取纯度高的DNA样品，以便进行后续的实验操作，如聚合酶链式反应（PCR）、限制性酶切、测序等。
2. 实验材料在进行质粒DNA提取实验前，需要准备以下实验材料：•细菌培养液：含有所需质粒的培养液。
•碱裂解液：用于裂解细胞并释放质粒DNA的实验液。
•高盐含量的溶液：用于提取DNA。
•蛋白酶K：用于消化蛋白质。
•硅胶粉末：用于吸附DNA。
•乙醇：用于沉淀DNA。
•TE缓冲液：用于溶解和储存提取的质粒DNA。
3. 实验步骤3.1 细菌培养与收获首先，需进行细菌培养和收获，以获取含有所需质粒的培养液。
培养液中的细菌应为含有目标质粒的菌株，如大肠杆菌。
3.2 细胞破碎与质粒DNA释放将收获的细菌培养液进行离心，去除培养液并沉淀细胞。
然后将细胞重悬于碱裂解液中，用震荡器在适当的温度和时间条件下裂解细胞，释放质粒DNA。
3.3 蛋白质消化为了去除细胞中的蛋白质，加入适量的蛋白酶K，进行蛋白消化。
消化的时间和温度应根据实验要求进行调整。
蛋白消化完成后，通过离心将蛋白质沉淀分离。
3.4 DNA提取将消化液中的DNA溶液转移到其它离心管中，并加入高盐含量的溶液。
通过离心将DNA与其他杂质分离。
此步骤中，DNA会被溶液中的硅胶粉末吸附，以去除杂质。
3.5 DNA沉淀将去除杂质的DNA溶液转移到新的离心管中，加入冰冷的乙醇。
通过离心，将沉淀的DNA分离出来。
注意，在沉淀过程中，应避免DNA的过度离心，以免损坏DNA分子。
3.6 DNA溶解和储存将DNA沉淀后，溶解在适量的TE缓冲液中。
TE缓冲液具有适当的pH值和离子浓度，能够稳定DNA分子，并提供良好的保存条件。
4. 实验注意事项在质粒DNA提取实验中，需要注意以下几点：•操作过程应严格遵守无菌操作，避免外源性DNA的污染。
质粒DNA的提取与PCR
带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电
场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛 效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动 速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离 不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质
பைடு நூலகம்
量相同,但构型不同的DNA分子。
• 在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式（cccDNA）
700ul）于一新的Eppendorf管.加入等体积
异丙醇,混匀后放置5分钟,12000rpm离心10
分钟,弃去上清.
(6)用无水乙醇清洗一次,离心管倒置在吸水
纸上2min,自然干燥. (7)加入20ul TE 溶液溶解提取物,充分溶解. (8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.
五、电泳检测试验结果
六、结果分析
粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生 素耐药性等。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本
步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；
分离和纯化质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高
pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂， 将质粒DNA释放到上清液中。碱性溶剂使碱基 配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于 拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
4.灭菌水
5.0.2ul Eppendorf 管
四.试验步骤:
（一）PCR体系： PCR Mix 10ul H2O 9 ul 引物1 0.5ul 引物2 0.5ul 质粒模版 0.5ul
(二) PCR循环条件 94℃ 3 min 94℃ 30 s 60 ℃ 30 s 30 cycle 72 ℃ 1 min 72 ℃ 7 min 4℃ forever 电泳检测实验结果
存在。在提取质粒的过程中，还有另外两种存
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
质粒DNA的提取和PCR技术
3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
操作步骤注意事项： 操作步骤注意事项
1。配置反应体系。 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 1ul 4种dNTP混合物 200umol/L 引物 各1～10pmol 模板DNA 10～200ng Taq DNA聚合酶 0.25u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 10ul 2。 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 50℃ 1分钟， 72℃ 1.5分钟， 共30轮循环。 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 电泳结束，观察
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳 性的产生。
吸样枪:吸样枪污染值得注意.由于操作时不慎将样品或模板核酸 吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源。吸头、小离心管应 一次性使用 。 开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免 污染。 2。预混和分装PCR试剂:PCR反应液应预先 配制好，然后小量 分装。节省时间并保证各管成分平行 。最好在加样时都在冰上 低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。 3。阳性对照与阴性对照的设立。-重要！ 阳性对照与阴性对照的设立。 重要！ 阳性对照与阴性对照的设立 重要 有利于问题的解决， 有利于问题的解决，对于优化条件以及排除污染可能性都很有 用！
质粒微型试剂盒dna提取基本步骤
质粒微型试剂盒dna提取基本步骤质粒微型试剂盒DNA提取基本步骤DNA提取是分子生物学研究中的关键步骤之一，而质粒微型试剂盒则是一种常用的DNA提取工具。
下面将介绍质粒微型试剂盒DNA 提取的基本步骤。
第一步：样本准备需要准备待提取DNA的样本。
可以是细菌培养物、动物组织或植物材料等。
将样本转移到离心管中，并进行离心，将细胞沉淀在离心管底部。
第二步：细胞溶解将样本中的细胞溶解，常用的方法是加入裂解液，通过裂解液中的化学物质或酶的作用，使细胞膜和核膜破裂，释放出DNA。
裂解液中的成分可以包括缓冲液、蛋白酶K和SDS等。
第三步：蛋白质沉淀为了去除样本中的蛋白质，需要进行蛋白质沉淀。
可以通过加入盐溶液或乙醇来使蛋白质凝集沉淀。
然后，离心管进行离心，使蛋白质沉淀到离心管底部。
第四步：DNA沉淀将上一步得到的蛋白质沉淀去除后，可以通过加入乙醇使DNA沉淀。
乙醇可以使DNA分子凝聚形成沉淀，然后通过离心将DNA沉淀到离心管底部。
第五步：洗涤和溶解将DNA沉淀洗涤去除离心管中的杂质，常用的洗涤液包括乙醇和盐溶液。
然后，使用适当的缓冲液溶解DNA沉淀，使其溶解成无色透明的溶液。
第六步：测定DNA浓度可以使用紫外吸收光谱法或荧光染料法等方法测定DNA的浓度。
通过测定吸光度或荧光强度，可以确定提取得到的DNA的浓度。
以上就是质粒微型试剂盒DNA提取的基本步骤。
通过这些步骤，我们可以从样本中提取到高质量的DNA，并用于后续的实验研究。
DNA提取是分子生物学领域中不可或缺的一步，它为我们揭示生物的遗传信息提供了基础。
希望这些步骤能够对您有所帮助！。
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基本原理：
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互 补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤 构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使 之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度 降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循 环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～ 4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。 2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿 异戊 醇时要在通风橱中进行，氯仿 可引起神经系统功能紊乱要引起 肝脏损害 。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有 刺激作用 3。电泳时注意避免EB污染。
PCR技术
基本原理 反应动力学 使用步骤及注意事项 反应参数要素 PCR优化
操作步骤注意事项：
1。配置反应体系。 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 1ul 4种dNTP混合物 200umol/L 引物 各1～10pmol 模板DNA 10～200ng Taq DNA聚合酶 0.25u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 10ul 2。 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 50℃ 1分钟， 72℃ 1.5分钟， 共30轮循环。 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 电泳结束，观察
作用沉淀
4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为
tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降 低表面张力，可以减少泡沫
5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml
操作步骤及注意事项
1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中， 于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细
菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。
2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可 能流尽。 3.将细菌沉淀重悬于100μ l预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振 荡，使菌体分散混匀。 4.加200μ l新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要 剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞 膜裂解,DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下
PCR的反应动力学 ：
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反 应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。平均扩增效率的理 论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应曲线：反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随 着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加， 而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应 称平台期数（原因：PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和 活性及非特异性产物的竟争等因素）。
PCR技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有 特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易 自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目 的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍,使肉眼能直接观察和判断 。-可以用于基因克隆， 目的基因检测等。 发展：Taq DNA聚合酶：分离于温泉菌中，耐高温。 PCR和TaqDNA聚合酶被美国《科学》杂志1989年的 “年度分子”，并被列为80年代10项重大科学发明之 首
质粒DNA的提取和 PCR技术
质粒提取
基本原理 操作步骤 注意事项 实验室安全
基本原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至 200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独 立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已 成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是 最常用的方法。 基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加 入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后 形成PDS被离心时可沉淀下来。
6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿 /异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉
剩余蛋白。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7 倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可
以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太 久
8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将 沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。 9.沉淀溶于20μ l TE（含RNase A 20μ g/ml），37℃ 水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。
其它注意事项：
1。质粒质量： 首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提
取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作 过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。 质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝 数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。
2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了其碱性。
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
分装。节省时间并保证各管成分平行 。最好在加样时都在冰上 低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。 3。阳性对照与阴性对照的设立。-重要！ 有利于问题的解决，对于优化条件以及排除污染可能性都很有 用！
反应参数要素：
1。PCR反应五要素
（1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特 异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性： rTaq-1~2kbp,LaTaq-~20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应 中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L 。4种dNTP的 浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒， 噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分 子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状 分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯 化程度影响扩增效率。
引物设计原则：
1)引物长度约为18-30bp。 2)引物中G+C含量通常为40%-60%, G+C太少扩增效果不好，G+C过 多易出现非特异条带。GC含量决定引物的解链温度 Tm＝ 4(G+C)+2(A+T). 3)四种碱基应随机分布，在3‘端不存在连续3个G或C,因这样易 导致错配。 4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核 苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 5)在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。 6)两引物之间尤其在3‘端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少 产量。 7)引物5‘端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶 位点，通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳 定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 引物设计软件： Primer5.0, 6.0
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳 性的产生。
吸样枪:吸样枪污染值得注意.由于操作时不慎将样品或模板核酸 吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源。吸头、小离心管应 一次性使用 。 开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免 污染。 2。预混和分装PCR试剂:PCR反应液应预先 配制好，然后小量
2。PCR反应条件的选择：温度、时间和循环次数
温度与时间： 变性温度：一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 。太低解 链不完全，太高影响酶活。 退火(复性)温度与时间 ：退火温度影响PCR特异性的。太高不能 很好复性，太低会有非特异结合。提高退火温度可以提高特异 性。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度， 还有靶基序列的长度。选择合适的温度 ：Tm值(解链温 度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在此范围内进行优化。提高退火温度可以提高特异性。 复性时间一般为30～60sec 延伸温度与时间 ：一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃。 延伸速度一般1kb/min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的 出现。对低浓度模板的扩增，时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决 于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环 次数越多，非特异性产物的量亦随之增多