质粒DNA的提取和鉴定
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定
分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。
质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。
提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。
本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。
实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。
2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。
步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。
2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。
步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。
不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。
2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。
3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。
不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。
4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。
步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。
2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。
步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。
2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。
质粒DNA的提取定量PCR鉴定
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定量PCR：使用定量PCR仪进行定量PCR反应，获取质粒DN的拷贝数
提取质粒DN：使用碱裂解法或柱层析法等方法提取质粒DN
数据分析：使用定量PCR软件分析定量PCR结果，获取质粒DN的拷贝数
结果验证：使用电泳法或荧光定量PCR等方法验证定量结果
定量注意事项
确保样品的纯度和完整性
PCR反应需要四种主要成分：模板DN、引物、DN聚合酶和dNTP
PCR反应可以快速复制特定的DN片段，用于基因克隆、突变检测、基因表达分析等领域
PCR反应体系
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模板DN：提供待扩增的DN序列
DN聚合酶：催化DN复制
Mg2+：稳定DN聚合酶活性
酶抑制剂：防止非特异性扩增
电泳试剂：用于电泳分析的试剂，如溴化乙锭、琼脂糖等
荧光定量PCR仪：用于定量PCR分析的仪器
实验步骤和实验操作
质粒DN提取：选择合适的菌株，培养至对数生长期，然后进行质粒DN的提取。
PCR鉴定：设计特异性引物，进行PCR反应，然后进行电泳分析。
实验操作：按照实验步骤进行实验操作，注意操作规范和实验安全。
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因功能研究
PCR鉴定：用于基因突变、基因表达和基因功能研究
质粒DN提取和PCR鉴定：用于药物开发和生物制药
在基因工程中的应用
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因编辑等实验
PCR鉴定：用于检测基因突变、基因表达和基因拷贝数等实验
基因工程：通过改变生物的基因来改变其性状，如抗病、抗虫、抗除草剂等
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取与电泳检测
2008
分 子实 生验
物 学
2。质粒DNA的提取：
已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒 DNA， 这些方法都含有以下3个步骤：
◆ 细菌培养物的生长。 ◆ 细菌的收获和裂解 ◆ 质粒DNA的纯化。
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三. 仪器和试剂
试剂:
1、质粒快速提取试剂盒
溶液1（SET缓冲液）、溶液2（Lysis Buffer)、溶液3（3M NaAc,Ph4.8)、结合缓冲 液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集 管
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(5)向吸附柱加入700ul漂洗液， 12000rpm离心 30秒。倒掉废液，装回吸附柱。
(6)重复（5），再次12000rpm离心2分钟以完全 去除漂洗液。
(7)回收质粒：将吸附柱移到一个新的1.5ml eppendorf管中，向吸附膜中央加入50ul 洗脱 缓冲液（水浴预热至70度），溶解提取物,室 温放置2分钟，12000rpm离心2分钟.
(8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.
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五、试验结果 六、结果分析
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一. 实验目的
1.通过质粒DNA的提取和检测，掌握提取 质粒的方法以及用凝胶电泳分离鉴定质 粒DNA的方法。
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二. 实验原理
1.质粒概述:
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单 位，现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线 菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程 中质粒常被用做基因的载体。
(3)裂解：加入100ul溶液1（用完后4度保存）,充分吹打 混匀后, 加入150ul溶液2（用完立即拧紧瓶盖）,温和颠 倒5-10次,零下20度放置3分钟.加入150ul溶液3,温和颠倒 5-10次,放置5分钟. 12000rpm离心5分钟
质粒DNA提取与鉴定
电泳原理 电泳步骤
质粒DNA提取与鉴定
实验流程
2. 质粒DNA提取原理 3. 质粒DNA操作步骤 4. 紫外检测定量知识 5. 酶切原理、操作步骤 6. 琼脂糖电泳原理及步骤 7. 凝胶成像系统
质粒DNA 的提取
酶切分析 质粒定量
琼脂糖凝胶电泳
质粒DNA提取与鉴定
实验目的
➢ 掌握碱裂解法提取质粒的方法 ➢ 了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 ➢ 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作
▪ LB培养基（液体、固体） ▪ Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）
• 溶液 P1 • 溶液 P2 • 溶液 P3 • 去蛋白液 PE • 漂洗液 WB • 洗脱液 EB
质粒DNA提取与鉴定
溶液 I
• 50mmol/L 葡萄糖 • 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) • 10 mmol/L EDTA (pH8.0)
质粒DNA提取与鉴定
2、离心层析柱
基本原理
✓ 硅基质膜在高盐、低pH值状态下 选择性地结合溶液中的质粒DNA；
✓ 去蛋白液和漂洗液将杂质和其它 细菌成分去除；
✓ 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯 净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；
质粒DNA提取与鉴定
☆原理示意图
质粒DNA提取与鉴定
仪器材料
（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α （三）试剂：
➢ 根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 蛋白质或其它杂质的污染
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质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记
可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在
含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。 质粒含有启动子序列，能够自我复制。不过质粒的复制和转录都依赖于宿主编码的蛋白 和酶，或能在胞质中进行自我复制，或整合到细胞染色体中作为细胞遗传物质的一部分 随染色体一起复制。 质粒的特点使其成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载 工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
第二部分，质粒DNA的提取与鉴定
实验目的
掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解质粒酶切鉴定原理
质粒DNA的提取方法
方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒 DNA释放法；酸酚法等。 碱裂 解法有操作简便、快速、得率高的优点。
概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理
输入DNA序列
得到的分析结果
启动子区的分析
http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/
/seq_tools/promoter.html
CpG岛分析
/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2943
成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是
为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须 温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸 钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠 离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 2 M的醋酸是为了中和NaOH， 因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。 75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase。
综合性设计性实验-6
质粒载体的选择以及所插入的外源DNA 片段序列的生物信息学分析 质粒DNA的提取与鉴定 真核表达载体和RNA干扰载体的使用
此实验共包括如下三个部分
1. 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源 DNA片段序列生物信息学分析部分 2. 3. 第二部分，质粒DNA的提取与鉴定实验操作部分 第三部分，真核表达载体和RNA干扰载体的使用
质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。
以应用于毕赤酵母表达系统的pPIC9载体为例解释载体的构件
5‘AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇 的诱导下可启动外源蛋白的表达； α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序 列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于 外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插 入提供位点；
序列的查询与获得
/
输入基因名称
选择查询项目
点击“Go”
注意选择人属物种的基因
mRNA序列 蛋白质序列
基因组序列
运行DNAstar软件
点击“OK”
选取编码区序列
密码子使用分析 http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html
第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段 序列的生物信息学分析
质粒的基本知识
载体（vector）：能携带外源DNA进入细胞的运载DNA分子。载体按其行使的功 能分为克隆载体和表达载体，按组成元件的来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、 病毒载体等。 质粒（plasmid）大小在1kb～200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状 结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。质粒具有不相 容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其 在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。
TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；
HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3‘AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同 源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表 达载体在 E.coli 中筛选和复制。
根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细 菌内大量复制，得到大量的重组质粒。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解验所需)选择哪一种方法主要 取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验 要求。
碱裂解法基本原理
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部， EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金 属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制 DNase的活性，避免 质粒被酶降解。 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形
常用的克隆载体有： pGEM-T, pBR322, pUC18/19
表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目 的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。
常用的表达载体：
原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列 酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ 真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP， CMV4，pEGFT-Actin