实验五阳性克隆鉴定和质粒DNA的提取
重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体 的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应 的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进 行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外 源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以 利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组 子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大 小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子 中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的 基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因 的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合 到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基 因也可能正确表达.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其 解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超 过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速 置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平 板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素 时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带 插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选 效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色 菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表 达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质 粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.
阳性克隆鉴定和质粒DNA提取
确保质粒DNA的质量和纯度，可以提高阳性克隆鉴定的准 确性，为后续实验提供可靠的基因材料。
推动基因工程领域的发展
对阳性克隆鉴定与质粒DNA提取的关联性进行深入研究， 有助于推动基因工程领域的发展，为基因治疗、基因编辑 等应用提供技术支持。
05
实验设计与操作注意事项
实验设计原则
明确实验目的
根据研究目标选择合适的克隆鉴定和质粒DNA提取方 法。
选择合适载体
根据实验需求选择合适的载体，如质粒、噬菌体等。
设计引物
针对目标基因设计特异性引物，用于PCR扩增和测序 验证。
操作注意事项
无菌操作
精确计量
控制温度和时间
实验过程中需保持无菌 操作，避免污染。
准确称量试剂和样品， 保证实验结果的准确性。
团队协作
实验过程中，团队成员积极沟通、协作，共同解决遇到的问题，提高了实验效率。
不足之处
在实验过程中，我们也遇到了一些问题，如PCR扩增效率不高、质粒提取量不足等。这些 问题提醒我们在后续实验中需要更加注意细节，优化实验条件。
未来工作展望
深入研究
在后续实验中，我们将进一步研究重组质粒的功能和表达情况，以及其在细胞内的稳定性和传递 效率等问题。
严格控制实验过程中的 温度和时间，避免对实
验结果产生影响。
防止交叉污染
使用一次性枪头和离心 管，避免交叉污染。
实验结果记录与数据分析
详细记录实验步骤和数据
记录实验过程中的操作步骤、试剂用 量、温度、时间等关键信息。
数据分析
对实验结果进行统计分析，如PCR产 物电泳图谱分析、测序结果比对等。
结果解读
鉴定步骤
01
实验二 阳性克隆的筛选与鉴定、质粒DNA的提取(5学时)
实验二阳性克隆的筛选与鉴定、质粒DNA的提取（5学时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的筛选与鉴定方法。
二、实验原理：1、蓝白斑筛选原理2、碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、羧苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶四、实验步骤1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液2mL加入离心管中，4000r/min离心1min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在离心管中。
（每组至少做6管）3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的离心管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
冰上放置15min让质粒DNA复性(千万不可用旋涡震荡器)。
6、12000r/min离心10min，将上清转至另一个离心管中。
分子实验复习题
简述基因的克隆和表达的步骤1）获得目的基因和质粒载体；2）形成重组质粒；3）制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4）培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5）筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定；6）表达目的蛋白。
实验一：质粒DNA的提取及鉴定1.分子生物学实验常用载体有哪些?它们的特点是什么?常用载体：大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒、酵母人工染色体载体、动植物病毒载体。
特点：具有复制子（一段具特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制）、可检测的遗传表型、限制性内切酶单一识别位点（便于外源基因插入）、适合的拷贝数（有利于载体制备；使细胞中克隆基因的剂量增加）2.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些异同点？相同：提取的步骤基本上都属DNA的提取步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解。
不同：质粒提取过程中，有一个DNA变性、复性的过程，这个与基因组提取完全不同，这是利用质粒是以超螺旋结构存在于大肠杆菌中的特殊状态，分离纯化质粒时总是会利用这个特点来分离基因组DNA与质粒DNA。
3.核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？1）酚、氯仿作用是变性蛋白质。
酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
生物学实验 质粒DNA的提取
实验8 质粒DNA的提取（碱裂解法）一、实验目的了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。
二、实验原理碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。
碱性（pH 12.0~12.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。
当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。
三、仪器设备微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。
振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。
四、实验试剂（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。
4 ℃贮存。
（2）溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。
（3）溶液Ⅲ（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。
（4）RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。
五、实验方法（1）分装3 mL LB液体培养基和3 μL氨苄青霉素（50 mg/mL）于15 mL玻璃试管中。
（2）用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入玻璃管内，置37 ℃恒温摇床中以200转/min培养，至OD600=2.0。
寻找创新基因实验报告
一、实验目的1. 了解创新基因的概念和重要性；2. 掌握基因克隆和测序技术；3. 探索创新基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面的应用。
二、实验原理创新基因是指在生物进化过程中，由于基因突变、基因重组等原因产生的具有新功能或新性状的基因。
通过基因克隆和测序技术，可以筛选出具有创新性的基因，为生物科学研究提供新的思路和材料。
三、实验材料1. 基因组DNA；2. 克隆载体；3. 限制性内切酶；4. DNA连接酶；5. T4 DNA聚合酶；6. Taq DNA聚合酶；7. DNA测序试剂盒；8. 实验试剂和仪器。
四、实验步骤1. 基因克隆（1）提取基因组DNA，并用限制性内切酶进行酶切；（2）将酶切后的基因组DNA与克隆载体连接；（3）将连接产物转化大肠杆菌；（4）挑取阳性克隆，进行菌落PCR鉴定。
2. 基因测序（1）提取阳性克隆的质粒DNA；（2）进行PCR扩增目的基因；（3）将扩增产物进行测序。
3. 数据分析（1）将测序结果进行比对分析，确定目的基因序列；（2）分析目的基因的生物学功能，如表达模式、蛋白质结构等；（3）探讨目的基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面的应用。
五、实验结果与分析1. 成功克隆目的基因，获得阳性克隆；2. 通过测序，获得目的基因序列；3. 分析目的基因序列，发现其具有创新性；4. 研究发现，目的基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面具有潜在的应用价值。
六、实验结论通过本实验，成功寻找并克隆了具有创新性的基因，为生物科学研究提供了新的思路和材料。
实验结果表明，创新基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面具有潜在的应用价值。
七、实验讨论1. 基因克隆和测序技术在寻找创新基因过程中具有重要作用；2. 创新基因的研究有助于揭示生物体的生长发育、疾病治疗等生物学现象；3. 创新基因的研究为生物制药、农业等领域提供了新的材料。
八、实验展望1. 深入研究创新基因的生物学功能，为生物科学研究提供新的理论依据；2. 开发基于创新基因的生物药物，为疾病治疗提供新的手段；3. 推动创新基因在农业、环保等领域的应用，促进我国生物科技产业的发展。
分子生物学实验教材(精)
分子生物学实验教材：参考书：《分子克隆实验指南》（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一.[目的要求]通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二.[实验原理]细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
细菌处于0︒C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42︒C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。
三.[教学内容]1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介2.CaCl2法制备DH5α或JM109感受态细胞，计算转化效率3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞四.[实验材料和用品]E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。
超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等五.[实验步骤]一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
克隆实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握基因克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握质粒DNA的提取、目的基因的扩增、重组质粒的构建和转化等分子生物学实验技术。
3. 熟悉阳性克隆的筛选和鉴定方法。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体DNA分子中，构建成重组DNA分子，并通过转化宿主细胞使目的基因在宿主细胞内表达。
本实验采用PCR技术扩增目的基因，通过限制性内切酶将目的基因和载体DNA切割成相应的黏性末端，然后将目的基因片段插入到载体DNA分子中，构建成重组质粒。
最后，将重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 大肠杆菌菌株（如DH5α）- 质粒载体（如pUC19）- 目的基因DNA模板- 限制性内切酶（如EcoRI、HindIII）- DNA连接酶（如T4DNA连接酶）- 转化试剂- 抗生素（如氨苄青霉素）- 培养基（如LB培养基）2. 仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 电泳仪- 真空离心机- 显微镜四、实验步骤1. 目的基因的扩增：- 设计引物，根据目的基因序列设计特异性引物。
- 进行PCR扩增，将目的基因DNA模板与引物混合，在PCR仪中进行扩增。
2. 质粒DNA的提取：- 使用质粒提取试剂盒或碱裂解法提取质粒DNA。
3. 限制性内切酶酶切：- 将目的基因DNA和质粒载体分别用相应的限制性内切酶进行酶切。
4. DNA连接：- 将酶切后的目的基因DNA片段和质粒载体混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
5. 重组质粒的转化：- 将连接产物转化大肠杆菌宿主细胞，常用热击法或电穿孔法。
6. 阳性克隆的筛选：- 将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜。
- 从平板上挑取单菌落进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
7. 阳性克隆的鉴定：- 对阳性克隆进行酶切鉴定，确认重组质粒是否构建成功。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：- 通过PCR扩增，成功扩增出目的基因片段。
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【思考题】
1、如何提高大肠杆菌感受态细胞的效率？ 2、如何有效提高CaCl2法转化大肠杆菌的效 率？
碱法提取质粒是基于细菌染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性特征而达到分离目的的。在pH高达 12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双 螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也 断裂，但超螺旋共价闭合环状的质粒DNA两条互 补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲 液调节其pH至中性时，变性的质粒复性迅速而准 确，而细菌染色体DNA的两条互补链彼此已完全 分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠 绕形成网状结构，通过离心，细菌染色体DNA与 不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物以及细 菌碎片等一起沉淀下来而被除去。
7、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一 只收集管中，吸取500 µl Wash Solution到UNIQ10柱，10,000 rpm室温离心30秒。 8、重复步骤7。 9、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一 只收集管中，10,000 rpm室温离心30秒以彻底去 除Wash Solution。 10、将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5 ml 离心管 中，加50 µl DW （或Elution Buffer），室温放 置2分钟后，10,000 rpm室温离心1分钟。离心管 中的溶液即为所抽提的质粒DNA。
【仪器与试剂】
（一）、仪器
恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高 压灭菌锅等。 （二）、试剂
上海生工生物工程技术服务有限公司的 UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒
【实验步骤】
1、将培养好的1～2 ml细菌12,000 rpm离心15秒， 去上清。 2、加100 µl Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮 细菌。 3、加入200 µl Solution II，立即上下颠倒5～10次， 使细菌裂解，室温放置2分钟。 4、加入350 µl Solution III，立即上下颠倒5～10次， 使之充分中和，室温放置2分钟。 5、12,000 rpm离心，5分钟。 6、将步骤5中的上清转移到套放于2.0 ml收集管内 的UNIQ-10柱中，10,000 rpm室温离心15秒。
这样，LacZ基因编码α肽链与失去N端的β 半乳糖苷酶突变体互补，这种互补现象叫α 互补。由α互补而产生的Lac＋细菌易于识别， 因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落， 而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点 后，几乎不可避免地导致产生无α互补能力 的氨基端片段，因此带重组质粒的细菌形 成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简 化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。
实验五 阳性克隆鉴定和质粒DNA提取
【实验目的】
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
学习大肠杆菌转化阳性克隆的鉴定 学习碱法提取质粒DNA的方法和技术
【实验原理】 重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞后，还需要对转 化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是 最常用是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许 多载体（如pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA 的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ） 的调控序列和β-半乳糖苷酶α肽链氨基端（146个 氨基酸）的编码信息。这个编码区中插入了一个 多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个 氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响 功能。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部 分序列（ω片段）的宿主细胞。虽然宿主和质粒编 码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一 体，形成具有酶学活性的蛋白质 。