(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定
质粒DNA的提取和纯化实验报告
质粒DNA的提取和纯化实验报告实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。
2、初步了解DNA纯化的原理。
二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。
3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的Solution2 200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的Solution3 150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之后在1200r/min离心7min8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中（400-500微升）9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另一离心管10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min 下离心10min11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥13、加入1*TE 40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
质粒DNA的提取和纯化
质粒DNA的提取和纯化一、实验目的掌握碱法小量提取质粒DNA。
二、实验内容质粒DNA的小量提取。
三、实验原理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。
碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。
离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
四、实验方法与步骤㈠细菌培养和收集将带有pUC19质粒的大肠杆菌接种在LB固体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃培养12～24小时。
在超净工作台中用无菌的牙签挑取平板培养基上的单菌落接种到25ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃振荡培养（220rpm）约18小时至对数生长后期（OD600=0.6）。
㈡碱法小量提取质粒DNA1、将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，于4℃12000rpm离心30秒，弃去上清液，将剩余的培养物贮存于4℃。
重复3次，以得到较多的细菌沉淀（视具体情况而定）。
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴2～5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴2～5分钟。
6、4℃,12000rpm离心10分钟。
将上清液转入另一只1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟。
质粒DNA的抽提纯化与检测
提
酶 切 后
取 的 质 粒
2.5Kb 0.9Kb
点样孔（如果纯化不好，就可 能有DNA-蛋白复合物残留） 开环构型 线性构型 超螺旋构型（希望得到最多）
RNA残留
小结
1．质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒DNA，利用质粒 DNA与染色质DNA变性与复性的差异。
2．质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的DNA序
分子生物学实验（综合性）
真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测 质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定 感受态细胞的制备及重组质粒的转化 常规PCR技术
YL-1
实验
质粒DNA的抽提、酶切及 电泳鉴定
YL-2
实验安排
上午：质粒DNA 的提取与纯化
中午：质粒DNA 的酶切 下午：电泳鉴定
质粒
❖ 质粒(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在 的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合 环状双链DNA。
❖ 移液枪的正确使用
❖ 标记好自己的离心管
❖ 加不同溶液要换枪头
❖ 转移格平衡
注 意
（二）质粒DNA的酶切及 电泳鉴定
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶。
心5min，弃上清。 8. 加1mL冰预冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min。 9. 弃上清，室温放置5-10min，晾干沉淀。 10. 加20μL含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37℃水浴消化 15-30min以去
除RNA。
❖ 步骤5、6中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染 色体DNA也吸走。
质量的DNA片段在凝胶 中泳动速度不一样，因 而可依据DNA分子的大 小或构型来使其分离。
最新4质粒DNA的提取纯化与鉴定汇总
2、载体性质 （1）.复制能力； （2）.容纳外源DNA的能力； （3）.选择标记：抗生素耐受。 （4）.引入多克隆位点； （5）.引入重组选择标记。
3、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、 λ噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、 昆虫杆状病毒 3.穿梭载体
二、质粒DNA的分离纯化
（一）、细菌培养物的生长和收获 （二）、质粒DNA的提取
1、碱裂解法小量制备质粒DNA: a、细菌的收集； b、加入100цl溶液Ⅰ，重悬细菌； c、加入200цl溶液Ⅱ，使细菌悬液清亮； d、加入150цl溶液Ⅲ，冰上放置3-5分钟；
e、加入450цl酚：氯仿混匀； f、12000rpm，离心5分钟； g、吸取上清，加入2倍体积无水乙醇，室温
4、常用质粒载体 例如：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等
5、常用质粒宿主： HB101、DH5α、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等
静置2分钟； h、12000rpm离心5分钟，弃上清；
i、75%乙醇洗涤，室温晾干；
j、溶于适量TE/R中。
三、质粒DNA的鉴定
（一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯 度。
（二）、EB荧光Biblioteka 析 （三）、电泳鉴定在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与 分子量的对数值成反比关系。质粒DNA 经单一酶切后与DNA Marker进行电泳 对照，即可知该质粒的分子量大小。
质粒DNA提取及纯化
质粒DNA 提取纯化、DNA 电泳检测实验目的1．掌握质粒DNA 的制备的原理和方法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1．质粒DNA 的制备方法质粒(Plasmid) 是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA 。
质粒DNA 的制备包括3 个步骤：①培养细菌，使质粒DNA 大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA 。
主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS ；煮沸裂解法：沸水煮沸40 秒；SDS 裂解法：10%SDS ，一般用于质粒大量提取。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA 。
2．碱裂解法质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH 值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA 变性，去除变性条件又可以使DNA 复性。
碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA 和线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒DNA 。
SDS 是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA 及细菌基因组DNA 从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA 在操作过程中会断裂成线状DNA 分子，在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。
当加入pH4.8 乙酸钾缓冲液时，pH 恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
质粒DNA的提取及鉴定
二、实验原理
当pH=4.8的乙酸钾将其pH调到中性时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性， 形成缠绕的致密网状结构。同时，在反应体系中变性 的蛋白质会形成大量沉淀以及十二烷基磺酸钾沉淀， 染色体DNA会进一步缠绕在这些沉淀上。离心后，染 色体DNA与蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除 去，质粒DNA留在上清里。
水平电泳装置
四、实验操作
1、用碱裂解法提取质粒DNA：挑选单菌落小规模扩增后， 将2 mL含相应抗生素的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的 试管中，然后接种入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜， 收集细菌。
2、将细菌团块重悬于100μL用冰预冷的溶液Ⅰ（150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris–HCl，pH8．0，10 mmol/L EDTA， pH8.0）中剧烈振荡。加200μL新配制的溶 液Ⅱ(0.2mol/L Na0H, 1%SDS)盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，将离心管放置于冰上。
3）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械 剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
4）加入醋酸钾溶液后，可用小玻棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒 DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。溶解DNA，加入等体积 酚/氯仿抽提，取水相再用乙醇沉淀DNA。
四、实验操作
3、对提取的质粒DNA进行纯化及酶切鉴定： 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收 试剂盒纯化质粒DNA；分析质粒DNA的限制 性酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对质 粒DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切 产物。
五、 结果处理
利用凝胶成像系统进行检测
闭环(螺旋) 闭环(超螺旋) 开环(部分解链 )
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard 法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
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分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
2.凝胶电泳进行DNA分离纯化：电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。
各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。
凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。
含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。
利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。
因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA 片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。
此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。
需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。
这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5—500bp)的分离和蛋白质电泳。
它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。
虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。
琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。
琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45℃。
琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。
在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。
三、主要仪器和材料试剂：1.仪器和材料：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。
菌体：E.coli DH5α受体菌，具有Amp r标记的质粒pUC19。
2.实验试剂：LB培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭(EB),DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5.2的醋酸钠。
四、实验步骤：1.菌体培养：（1）配制40mL液体LB培养基（加入5%葡萄糖）、100mL固体LB 培养基、并准备足量的移液管、200μl微量移液器头、1000μl微量移液器头、50mL离心管、1.5mL离心管，灭菌备用。
（2）向液体LB培养基移取32μl氨苄青霉素，混合均匀。
（3）将提前活化的E.coli DH5α受体菌，接种于液体LB培养基中。
将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min 培养12-16h 。
2. 质粒DNA 的提取：（1） 称量50mL 离心管重量W1，取30mL 菌液于已称重的50mL 离心管中，配平后6000r/min 离心5min 。
（2） 弃上清，向离心管中加入5mL 溶液Ⅰ，涡旋振荡，6000r/min离心5min 。
（3） 弃上清并称重W 2，求W=W 2-W 1。
（4） 按照1.0mL/100mg 菌体的量加入溶液Ⅰ，充分涡旋振荡，冰浴5min ，再按照2.0mL/100mg 菌体的量加入溶液Ⅱ，温和颠倒混匀，冰浴2min ，然后再按照1.5mL/100mg 菌体的量加入溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，冰浴10min ，平衡后12000r/min 离心15min 。
（5） 取上清至新50mL 离心管内，记录体积，加入两倍体积的冰乙醇，混匀后在-20℃环境下保存30min 。
取出后12000r/min 离心15min ，弃上清，加入5mL70%乙醇，12000r/min 离心5min ，弃上清，加入5mL70%乙醇，12000r/min 离心5min ，弃上清，37℃放置5-10min 。
（6） 取出离心管，加入1mLTE 溶液得到粗提物，加入RNase A 液，使溶液浓度为150μg/mL ，37℃保存60-120min 。
3. 质粒DNA 的纯化：（1） 取500μl 粗提物于1.5mL 离心管中，加入等体积的Tris 饱和酚，混匀，12000r/min 离心10min 。
（2） 转移上清（体积V 1）至新管，加入等V 1的酚：氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/min 离心5min 。
（3） 转移上清（体积V 2）至新管，加入等V 2的氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/min 离心5min 。
（4） 转移上清（体积V 3）至新管，加入110V 3的3M NaAc 溶液（pH5.2），再加入2V 4（V 4=V 3+110V 3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30-60min ，取出后12000r/min 离心15min 。
（5） 弃上清，加入500μl 70%乙醇，10000r/min 离心2min ，再加入500μl 70%乙醇，10000r/min 离心2min ，37℃保存5-10min 。
（6） 取出离心管，向一只离心管中加入25μl TE 溶液，溶解沉淀后，转移入另一只离心管中，再取25μl TE 溶液加入第一只离心管中，溶解后再移入另一只离心管中，得到50μl 纯化质粒DNA 。
4. DNA 纯度检测：（1） 取40mLTAE （1×）于300mL 锥形瓶中，加入0.4g 琼脂糖，放入微波炉内使其熔化，60℃时倒入准备好的制胶槽中。
（2） 取5.0μl 纯化DNA 加入1.0μl 上样缓冲液，混合，进行点样。
（3） 点样完毕后，100V ，200mA 条件下电泳30min 。
（4） 电泳完毕后，进行EB 染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。
五、实验结果：凝胶成像仪拍照如下：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图1 DNA纯度检测凝胶成像结果（1号泳道：DNA marker λ/HindⅢ；2号泳道：超螺旋状态的pUC19质粒DNA；3号泳道：线性的pUC19质粒DNA；4号泳道：空泳道；5至9泳道：7至11组pUC19质粒DNA样品；10号泳道：λDNA）本组点样在第9泳道，照片显示各种杂质去除得较为彻底，得到了较高纯度的超螺旋状态的pUC19质粒DNA。
六、讨论：1.为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。
在整个质粒提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。
加入溶液Ⅰ时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。
加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。
因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。
2.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。
皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。
3.为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部，再用移液器移除液体。