BAC-PAC大型质粒提取试剂盒操作方法及步骤说明书
质粒提取试剂盒说明书
E.Z.N.A Plasmid Miniprep Protocol 质粒小规模提取试剂盒Product Number D6942 and D6943,D6944注意：1．使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存2．加60ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中. 室温保存除试剂盒外还需准备：可达到13000×g的离心机无核酸酶的离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)：1.在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml LB培养基LB（含氨苄青霉素50μg/ml），37cº振荡培养12-16h。
需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.2. 取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1min，去上清3. 加250µl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。
（用移液枪吹打进行重悬浮）4.加入250µl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。
最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。
(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)5.加350µl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀6.室温13000×g离心10min，紧凑的白色沉淀就会形成，迅速进行到下一个步骤7.特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。
要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。
室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱8.弃滤过液，加500µl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度以备后续试验使用。
如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略9.弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750µl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min，弃过滤液。
高纯度质粒大量快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://HighPure Plasmid Maxi Kit高纯度质粒大量快速提取试剂盒目录号：PL12试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次(PL1201)RNaseA（10mg/ml）－20℃750µl溶液P1 4℃77 ml溶液P2 室温77 ml溶液N3 室温77 ml去蛋白液PE 室温63 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇漂洗液WB 室温25 ml X 2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温20 ml吸附柱DC 室温10个收集管（50ml）室温10个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。
有效防止了质粒被核酸酶降解。
3.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速、方便，从150-300ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80 %左右。
质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒原理质粒提取试剂盒是一种用于提取质粒DNA的试剂盒，其原理主要基于离心、蛋白酶消化和硅胶膜吸附等方法。
在进行质粒提取实验时，首先需要将含有目标质粒的细菌培养物进行离心，将细菌沉淀物收集起来。
接着，通过加入蛋白酶等消化酶，将细菌细胞壁和膜等部分消化掉，释放出目标质粒。
最后，利用硅胶膜的吸附作用，将目标质粒吸附在硅胶膜上，再通过洗涤等步骤将杂质去除，最终得到纯净的质粒DNA。
质粒提取试剂盒的原理主要包括以下几个步骤：1. 离心，将含有目标质粒的细菌培养物进行高速离心，使细菌沉淀成为一个团。
这样做的目的是将细菌细胞从培养基中分离出来，为后续的蛋白酶消化提供条件。
2. 蛋白酶消化，将离心后的细菌沉淀物加入蛋白酶等消化酶，通过消化细菌细胞壁和膜等部分，释放出目标质粒。
这一步骤是质粒提取试剂盒中至关重要的一步，能够有效地将目标质粒从细菌细胞中释放出来。
3. 硅胶膜吸附，将经过蛋白酶消化的细菌沉淀物加入硅胶膜柱中，利用硅胶膜的吸附作用将目标质粒吸附在硅胶膜上。
硅胶膜具有很强的吸附能力，可以有效地将目标质粒与其他杂质分离开来。
4. 洗涤，通过洗涤等步骤将杂质去除，最终得到纯净的质粒DNA。
这一步骤是为了去除硅胶膜上的杂质和残余的蛋白酶等物质，使得提取的质粒DNA更加纯净。
总结来说，质粒提取试剂盒的原理是通过离心、蛋白酶消化和硅胶膜吸附等方法，将目标质粒从细菌细胞中提取出来，并最终得到纯净的质粒DNA。
这一原理简单易懂，操作方便，适用于实验室中的质粒提取工作。
通过对质粒提取试剂盒原理的深入了解，可以更好地进行质粒提取实验，并取得准确可靠的实验结果。
质粒提取试剂盒说明书
质粒抽提：质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
实验原理：提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。
详细内容请参考《分子克隆实验指南》。
另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。
碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL 以上。
煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。
加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA 变性。
但是。
闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。
当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。
无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南
详细内容：. ® (无内毒素质粒大抽提). 在升地培养瓶中加入培养基,然后加入菌种于℃摇床培养小时；文档收集自网络，仅用于个人学习:为获得最好地结果，请接种培养过夜地菌种（）.并强烈推荐使用()品系用于常规地质粒提取，如和.注意：菌液地培养时间不能超过小时；文档收集自网络，仅用于个人学习. 收集培养基至适当地离心管，室温下，×离心分钟沉淀；. 吸尽并去除培养基，用干净地吸水纸吸尽壁上多余地液体.加到细菌培养物中，涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞；文档收集自网络，仅用于个人学习注：充分重悬细菌沉淀物对获得高产量地质粒是相当关键地.充分重悬后溶液是均匀地，不存在小块物质；请尽量吸弃残余地培养基以防止稀释加入地溶液；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入，轻轻颠倒旋转混匀次至获得澄清地裂解液；室温放置分钟可以有是必须地.避免剧烈振荡混匀而打断染色体，降低质粒地纯度.（使用后请盖紧盖子且于室温保存）；文档收集自网络，仅用于个人学习. 将取出活塞，将其放置于架子上；. 加入，轻轻颠倒混匀几次至出现絮状沉淀.这可能需要放置分钟并间断颠倒混匀；文档收集自网络，仅用于个人学习. 立即将裂解液转移到中，垂直放置分钟.这时白色地絮状沉淀物会漂上溶液地上层，裂解液可能开始流出过滤器，用新地管子收集细菌裂解液，并将活塞轻轻插入过滤器中；文档收集自网络，仅用于个人学习. 握住过滤器，轻轻推动活塞将裂解液打到收集管中；注意不要将任何杂质打到收集管中；. 加入体积地（蓝色）到收集液中，轻轻颠倒旋转混匀次，冰浴放置分钟；注意：加入后，溶液应变得浑浊，但冰浴静置后溶液应是澄清地.文档收集自网络，仅用于个人学习. ℃孵育分钟，溶液重新变为浑浊.室温下，×离心分钟，（蓝色）分层于离心管底部.文档收集自网络，仅用于个人学习. 把上面地水相（上清液）转移到新地离心管中，加入体积地，轻轻颠倒旋转混匀次.注意：转移上清液时不要吸到任何溶液，因为其含有高浓度地内毒素；文档收集自网络，仅用于个人学习. 平衡柱子：用套在收集管中，加入至柱子中，室温下×离心分钟；去除滤过液并重复使用收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入澄清地裂解液至柱子中，×离心分钟.去除滤过液并重新收集管；. 将剩余地裂解液加到柱子上，按上述条件离心，去除滤过液并重新使用收集管；. 加入至柱子中，×离心分钟，去除滤过液并重新使用收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入(已用乙醇稀释)至柱子中，×离心分钟，去除滤过液并重新使用收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入至柱子中，×离心分钟，去除滤过液和收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 将柱子套在新地离心管中，加入或水至柱子地基质.室温下×离心洗脱.文档收集自网络，仅用于个人学习. ® ( )文档收集自网络，仅用于个人学习. 按步骤准备澄清地裂解液；. 平衡柱子：将同真空装置相连接，加入至柱子中，提供真空分钟至裂解液完全滤过膜；文档收集自网络，仅用于个人学习. 将澄清地裂解液至柱子中，提供真空让所有地溶液滤出柱子；加入至柱子，提供真空吸尽液体；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入（已经用无水乙醇稀释）至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；文档收集自网络，仅用于个人学习. 重用至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；溶液滤出柱子后，将柱子转移至收集管中，另外提供真空分钟，室温下，×离心分钟以洗脱.第二次洗脱可能是需要地；文档收集自网络，仅用于个人学习. 去除柱子，然后将产物保存于℃.。
质粒提取试剂盒提取步骤
质粒提取试剂盒提取步骤1、用1.5 ml离心管收集5-6 ml菌液。
12,000 rpm离心1min，弃上清。
●应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。
菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。
菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。
2 、加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。
室温静置1- 2min。
●初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于 4℃保存。
可保存6 个月。
●不要残留细小菌块。
菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA 得率的高低。
●室温静置1-2 min 是为使溶液中的RNA 被充分降解。
3 、加入250 μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。
室温放置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
●若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。
待恢复至室温后使用。
沉淀的出现不会影响质粒DNA 的纯化结果。
●不可剧烈混和，否则会使染色体DNA 断裂。
●此步骤不宜超过5 min。
4、加入350 μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。
此时会出现白色絮状沉淀。
5 、12,000 rpm 室温离心10 min，收集上清。
6 、将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2 min。
●如果收集的上清液过多，超过DNA 纯化柱容积（800 μl），可将上清分次加入DNA 纯化柱中。
7、 12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。
●此时质粒DNA 被吸附于DNA 纯化柱的硅胶膜上。
8 、加入500 μl 溶液HB（异丙醇），12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。
●此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9 、加入500 μl溶液Wash DNA buffer，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。
●溶液W 初次使用前用无水乙醇按1: 1.5 稀释，即含60%乙醇。
质粒抽提原理及详细操作步骤
质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，无菌水28.5 mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
质粒大提试剂盒说明书
北京索莱宝科技有限公司质粒大提试剂盒说明书货号：D1110规格：10次保存：常温保存，复检期一年。
试剂盒内容：RNaseA(10mg/ml)1ml溶液Ⅰ60ml溶液Ⅱ60ml溶液Ⅲ80ml漂洗液2×15ml洗脱液30ml吸附柱10个收集管(50ml)20个说明书1份产品说明：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，一般从50-100ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA，提取率达85-90%。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。
溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
操作步骤:第1页共3页1.收集50-100ml过夜培养的菌液11000rpm离心10分钟，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入5ml溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3.向离心管中加入5ml溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。
②作用时间不要超过5分钟，以免质粒受到破坏。
4.向离心管中加入7ml溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀(如菌液过多，可在此步放置5分钟，以尽可能的降解RNA)。
11000rpm离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。
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杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://
BAC/PAC DNA Kit
BAC/PAC大型质粒提取试剂盒
目录号：PL2001
❖适用范围：
适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型质粒制备
❖试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成保存20次
RNaseA
-20℃ 1.3ml
（10mg/ml）
溶液P1 4℃130ml
溶液P2 室温100 ml
溶液PⅢ室温110 ml
杂质清除剂A 室温 3 ml
杂质清除剂B 室温30 ml
内毒素清除剂-20℃10 ml
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg /ml）
置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.内毒素清除剂在4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在－20℃!
3.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热
几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时
盖紧盖子。
❖产品介绍：
常规的离心柱型质粒抽提试剂盒并不适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型质粒DNA的抽提。
这主要是因为大型质粒DNA分子量很大，常常会超过100kb而且一般拷贝数低产量低，使用常规的离心柱吸附膜吸附效率和产量很低而且过膜会打断这些大分子量的质粒DNA。
本试剂盒采用改进碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。
纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。
纯化后期过程均在1.5ml离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。
本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是100kb甚至200kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。
此外溶液型的试剂可以按照比例放大缩小进行小提/中提/大提，最后可选择任意小体积溶解质粒，浓度可高达3μg/μl。
❖产品特点：
1.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速、方便、从150
ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取典型产量30-50μg高纯度BAC质粒DNA，提取率达80-90 %。
2.获得的质粒产量高，超螺旋比例高，纯度好，可直接用于转染、测序、文库等各
种分子生物学实验。
3.内毒素含量极低（< 0.1 EU/μg DNA），可直接应用于细胞转染。
❖注意事项
1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝
质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2.提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对
DNA的损坏。
3.DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。
如未见沉淀，担心DNA丢失，
可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。
4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260
值为1相当于大约50μg/ml DNA。
电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。
本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。
❖操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
⇨提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8℃保存。
1.取过夜培养菌150 ml左右菌液（最大不超过180ml-200ml），装入合适的离心瓶
中，10,000 x g于4℃离心2 min沉淀菌体，完全弃除上清。
2.加入5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。
细菌悬液移入50 ml离心管中，室温放置3~5 min。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3.加入5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置4-5 min，使细菌完全裂解，
溶液透明。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。
此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。
如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4.加5 ml溶液PⅢ，立即颠倒离心管6~8次，充分混匀，至白色絮状物产生。
上述
裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml 离心管中。
加入溶液PⅢ后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
5.加入10 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。
注意：使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。
如果你习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。
6.于4℃12,000~16,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干
残余液体，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉淀。
DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。
注意：异丙醇离心沉淀后，质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀，但是不影响产量，后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。
7.加入1.4 ml 溶液P1完全溶解沉淀团块，注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽
然可能看不见，也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。
然后将质粒溶液转入2个新的1.5 ml离心管中（每个700μl）。
可选步骤（一般不需要）：如果菌株RNA丰富有微量RNA残留，可在此步骤后将质粒溶液60℃孵育15 min消化RNA。
8.每管加入55μl杂质清除液A，颠倒充分混匀后加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的
内毒素清除剂，颠倒旋转7-10次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置>=5分钟，中间偶尔颠倒混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。
注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入55μl杂质清除液A，充分混匀后冰上放置5分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤11。
9.42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42℃温育5分钟。
10.室温14,000 x g离心5 min分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须
至少20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度20℃以上）。
上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。
将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤9-10。
11.将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约750μl），轻柔混匀，4℃
14,000 x g离心10 min，弃上清（注意不要丢失DNA），轻轻加入1 ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干5~10 min使乙醇完全挥发。
12.每个离心管加适量TE或者纯水（50~100μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振荡以
辅助溶解）。
要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。
最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解，这样可以得到很高浓度的转染级质粒DNA（高达3-5μg/μl）。
如果有需要，客户也可以选择更大体积溶解。