碱裂解法提取质粒操作步骤开始操作
SDS碱裂解法制备质粒DNA
SDS碱裂解法制备质粒DNA步骤（1）挑取转化后的单菌落，接种到2ml的含有适当抗生素的丰富培养基中，37℃振摇培养过夜（培养物的体积小于溶液体积的1/4，否则容器不易盖紧，剧烈振摇培养）（2）收菌，将菌液倒入离心管中，4℃，12500r/min，3min。
（离心后将上清液倒入费废液缸中，倒扣在吸水纸上，若还有液体残留，用移液枪吸出）（3）将细菌沉淀重悬于100μl的预冷的碱性裂解液I（Glu, EDTA, Tris-Hcl）中，涡旋振荡。
（4）加200μl新配置的碱性裂解液II(0.2M NaOH,1%SDS)于每管细菌重悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混合内容物，切勿振荡，将离心管放置在冰上3-5min. （5）加150μl预冷的碱性裂解液III（CH3COOH,CH3COONa），盖紧管口，反复颠倒数次，使得溶液在粘稠度额细菌裂解物中分散均匀。
冰上防止3-5min。
（6）离心（4℃，12000r/min，6min），并将上清转移到另一个离心管中。
（7）在通风橱内加400μl的氯仿：异戊醇（24:1）（8）抽提：将管放在漂浮板上，划8字8min，后离心（4℃，12000r/min,7min），吸取上清液300μl到另一个离心管中。
（9）加无水乙醇600μl，混匀放置在-20℃沉淀15min，后离心（4℃，12000r/min,15min）（10）小心吸去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，加70%乙醇700μl洗涤沉淀，弹起沉淀，浸泡一会，离心（4℃，12000r/min,4min），洗涤两次。
（11）倒掉上清，甩一下，吸去上清，晾干。
（12）TRE溶解（1mlTE，1μlRNA酶）20μl/管。
（13）65℃15min，后4℃冰箱保存。
质粒提取的原理及步骤
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
溶液Ⅰ50mM 葡萄糖/ 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置[t2]。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
碱裂解法提质粒原理详解
碱裂解法提质粒原理详解碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法。
它利用高碱性溶液对细菌的细胞壁和膜进行破坏，释放出细胞内的质粒。
下面将详细介绍碱裂解法的原理及其步骤。
碱裂解法的原理基于细菌细胞壁和膜对碱性条件的敏感性，而质粒较为稳定，可以在高碱性溶液中存活。
在碱性条件下，细菌的细胞壁和膜会发生严重的破坏，释放细胞内的质粒。
此外，高温和刺激性离子（如氢氧根离子）也可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
碱裂解法的步骤如下：1.首先，从含有目标质粒的培养基中取得细菌菌落，将菌落转移到含有适当抗生素的培养基中进行培养。
这是为了确保获得含有目标质粒的细菌。
2.将培养好的细菌转移到含有高盐浓度的溶液中。
高盐浓度可以破坏细菌细胞壁的结构，促进质粒的释放。
3.加入碱性溶液，通常使用0.2MNaOH或0.1MNaOH。
高碱性条件可以破坏细菌细胞膜，释放质粒。
此外，高温还可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
4.在碱性条件下，轻轻搅拌混合物，以促进细胞壁和膜的破坏，并使质粒更易于释放。
5. 加入中和缓冲液（例如Tris-HCl），以中和溶液的pH值。
这是为了避免碱性条件对质粒产生不利影响。
6.将混合物进行离心，以分离细胞碎片和质粒。
离心过程中，较大的碎片会沉淀在离心管底部，而质粒会悬浮在上层液体中。
7.将上层液体转移到新的离心管中，并进行再次离心。
这是为了进一步净化质粒，去除可能残留的细胞碎片。
8.倒掉上清液，并用含有合适抗生素的培养基再次进行培养。
这是为了筛选出仍然带有目标质粒的细菌。
总的来说，碱裂解法通过破坏细菌的细胞壁和膜，释放出细胞内的质粒。
该方法简单、快速，并且适用于大多数质粒的提取。
然而，需要注意的是，碱裂解法也会破坏部分目标蛋白质的结构，因此在选择提取方法时需要综合考虑。
实验二 碱裂解法抽提质粒DNA-2
实验一、碱裂解法抽提质粒DNA
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在 基因操作中具有重要作用。 质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、 细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。
3、乙醇沉淀：是从水溶液中回收核酸的标准方法。乙醇能够消除核酸的水
化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+之类的平衡离子能够与这 些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因
此，只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇
沉淀。
思考题（质粒抽提）
1、为什么真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提？
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
一、实验目的
1、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用； 2、掌握常用分子生物学试剂的配制；
3、掌握无菌操作技术；
4、掌握大肠杆菌的培养、保存及液体培养物OD值测定的方法； 5、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法；
6、学会根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。
7、离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干（或热板上烘干1 min）。
8、根据DNA沉淀的大小加20~50 l 1× TE 溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育 10分钟（可使DNase失活），之后于 -20 ℃保存备用。
质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及 其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 使用相对过量的试剂 — 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处 是：稳定性好，纯度高，操作更简单。 关注溶液I、溶液II和溶液III的比例！
碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化
实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。
二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。
三、实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1）在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜；（已经完成）（2）取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（3）加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；（4）加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5）加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min；（6）12000rpm离心5min；（7）吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8）小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9）加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理是利用碱性溶液将细菌细胞膜溶解，从而释放出质粒。
具体步骤如下：
1. 首先，培养含有目标质粒的细菌菌株，并收集足够数量的细菌细胞。
2. 将细菌细胞离心沉淀，去除上清液。
3. 使用含有碱性成分的溶液，如含有氢氧化钠和EDTA的碱
裂解液，将细菌细胞重悬。
4. 碱性溶液中的氢氧化钠会破坏细菌细胞膜的完整性，并且EDTA会螯合钙离子，进一步增强细菌细胞膜的脆弱性。
5. 经过一定时间的碱裂解作用，细菌细胞膜将被溶解，质粒被释放出来。
6. 使用中性化溶液，如盐酸或磷酸，可以调整溶液的酸碱度，使其接近中性，从而停止碱裂解的作用。
7. 利用离心的方法，将碱裂解液中的细菌残渣和其他杂质分离，得到含有质粒的上清液。
8. 最后，可通过柱层析等方法对上清液进行纯化，以获取纯净的质粒。
这种碱裂解法提取质粒的原理是利用碱性溶液破坏细菌细胞膜，从而释放出质粒。
与其他提取方法相比，这种方法简单易行，成本低廉，并且适用于大规模提取质粒。
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（沉淀DNA）
（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积 的无水乙醇， 置-20℃沉淀10－15 min。
上午实验结束
下午实验内容
１ 继续提取质粒： 获取及溶解沉淀的质粒DNA 2 质粒DNA电泳分析：
继续实验操作
（7） 12,000 转/分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。
（去除RNA）
（8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合。 37 ℃保温10min
20 l质粒 DNA溶液
取出10 l放于另一个离心管中备用 剩余10 l用于下一步酶切
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋>线性>开环
重组质粒的鉴定
平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有 或未含有质粒的细胞，却无法区分含 有空质粒或重组质粒的细胞 提取的质粒
质粒电泳筛选重组质粒
重组质粒的进一步酶切鉴定
质粒电泳
空质粒 重组质粒
质粒酶切电泳
a:酶切前 b:酶切后
重组质粒分子量变大 而在电泳中滞后 注： 观察质粒的电泳带型
2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体
0.2mol/L
NaOH
1%
SDS
录像5分钟：（8：20~8：25）
3）中和液（溶液III） ----中和NaOH
60 ml
5mol/L 醋酸钾
11.5ml
冰醋酸
28.5ml
水
4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。
分析质粒切不开的原因。
插入片段
3、怎样去除蛋白质？ （已经学过） 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.
碱裂解法提取质粒试剂：
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0
10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0
特点：纯度最高（可获得
缺口环状或 线状DNA
闭环质粒DNA
高质量的超螺旋质 粒DNA）、最贵、 最麻烦
应用：大量制备质粒；基 因注射，基因转染 等对质粒质量要求 高的实验
常用方法：小量碱裂解法
特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）
测序、转染（细提）
质粒提取试剂盒
满足不同需要的试剂盒
质粒载体
筛选标记 MCS（多克隆位点） 复制原点
质粒提取原理：
质粒提取有多种方法，但 都包含有3个基本步骤： 1)培养细菌使质粒扩增； 2)收集裂解细菌； 3)分离纯化质粒DNA。
√去除蛋白质 √去除RNA
*酚-氯仿抽提法 *RNase消化
√去除基因组DNA
？？？
质粒DNA与基因组DNA的区别
1、部位不同： 2、大小不同：
大肠杆菌遗传物质
质粒分子量较小，大小只 有普通细菌染色体DNA的百分 之一。
基因组DNA分子量较大， 细菌基因组约含3000个基因， 5106 bp。
基因组DNA容易断裂线性化
碱裂解法提取质粒的原理
原理：
1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱 性条件下发生变性。
2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形 成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；
纯化原理：离子交换柱层析等
小量制备质粒kit 大量制备质粒kit 去除内毒素制备质粒kit
可用于大部分分生实验
质粒的电泳
开环 线性 超螺旋
质粒DNA的存在形式有3种: 1、共价闭环DNA:常以超螺旋 形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链 中有一条发生一处或多处断裂 ，因此可以自由旋转从而消除 张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成.
取10 l 的质粒DNA 加2 l 上样液混匀。 加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。 电泳条件：100V 40min。 电泳结束后照像保存，结果分析。
质粒提取方法
电泳时讲授10-20min
质粒的量 质粒的纯度要求
质粒的大小
决定使用不同的方法
如：
如：
质粒过大：温和裂解
质粒大小适中：碱裂解，煮沸法
上次实验小结1、观察自己组的实验结 果 Nhomakorabea转化平板
*培养板在37oC 培养12-16h 卫星菌：培养时间过长
2、实验中的难点
*制备效率高的感受态细胞
实验四
开始实验操作前：本次实验介绍10-15min
小量制备质粒和电泳分析
质粒……
质粒
是存在于细菌染色体外的小型闭 合环状双链DNA分子，在宿主细 胞内可独立自主复制并赋予宿主 细胞一定的遗传性状
（3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置
冰上 5min， 12,000转/分， 4℃离心 5min。
（去除蛋白质）
（4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色 沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25： 24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。
质粒DNA的制备
开始操作：
碱裂解法提取质粒操作步骤
（1）（细菌的收获：）
取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。
（2）（细菌的裂解：）
加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌 加入200l细菌裂解液（溶液II）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。
注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。
大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂 小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法
质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等 （满足各种转基因实验的要求） 要求不同的纯化方法
方法举例：
经典的方法：CsCl-溴化乙锭梯度密度离心
原理：不同结构和大小的DNA参入的溴化乙锭的量不一 样从而在CsCl梯度密度离心中处于不同的位置