质粒DNA的提取(碱裂解法)
质粒DNA的提取-碱裂解法实验原理及步骤
实验二质粒DNA的提取－碱裂解法一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。
二、仪器及试剂1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.试剂及配制：LB培养液的配制：酵母浸提物 5.0 g；胰蛋白胨 10.0 g；NaCl 10.0 g；依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH （约0.2 ml）调节培养液的pH值至7.0。
碱裂解法提取质粒DNA的研究
碱裂解法提取质粒DNA的研究碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
该方法通过将大肠杆菌等细菌细胞进行碱性处理，使其细胞壁溶解，并释放出质粒DNA。
以下是对碱裂解法提取质粒DNA的研究进行详细介绍。
首先，进行实验前的准备工作。
实验材料包括大肠杆菌含质粒的培养液，碱性裂解液，中和液，以及一些常规实验室工具。
准备条件优化的培养基，如Luria-Bertani培养基，以获得高质量的质粒DNA。
将培养的大肠杆菌细胞进行离心，取得细菌细胞的沉淀，并将其重悬于适量的碱性裂解液中。
碱性裂解液的配制对提取质粒DNA的质量具有重要影响。
通常，碱性裂解液包括Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）、EDTA （0.1M，pH 8.0）以及SDS（0.5%-1.0%）。
在碱性裂解液中，细胞壁受到破坏，并且其中的DNA被释放出来。
为了进一步提取质粒DNA，需要添加RNase A（最终浓度为20μg/mL）来降解细胞中的RNA。
此外，可以根据需要添加蛋白酶K（最终浓度为100μg/mL）来去除大部分的蛋白质。
接下来，使用酒精沉淀法来纯化质粒DNA。
首先，加入等体积的冰冷异丙醇，使DNA和异丙醇充分混合，然后进行离心。
在高速离心后，离心管底部会形成一个白色的DNA沉淀。
利用移液枪将上层液体倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，移液枪将乙醇沉淀洗涤掉。
最后，利用离心机将样品离心至全速，将乙醇溶液除去，并风干沉淀。
最后，使用合适的缓冲液溶解DNA，以达到所需的浓度。
为了确定提取的质粒DNA的纯度和浓度，可以使用紫外光谱仪来测定其260nm和280nm的吸光度比值。
这个比值可用于评估质粒DNA中的蛋白质污染情况。
如果蛋白质污染特别严重，可以使用氯仿、酒精沉淀等方法进行进一步清除。
此外，还可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测提取的质粒DNA的大小和完整性。
通过比较不同样品的DNA迁移位置，可以快速确定质粒DNA的大小。
总结：碱裂解法是一种非常常用且简单的提取质粒DNA的方法。
南医质粒DNA的提取(碱裂解法)
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2011级临床八年制组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心【预习报告】一、实验原理1．质粒DNA的制备方法质粒是一种共价闭合环状双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，大小介于1～200Kb之间，在细菌细胞中含量最多。
质粒独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传,表达所携带的遗传信息,所以常被用作基因工程的载体。
质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
主要方法包括：碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。
2．碱裂解法从细菌中分离质粒DNA时，首先采用溶酶菌破坏菌体细胞壁。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。
当加入pH4.8 NaAc高盐缓冲液时，pH恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们与变性的蛋白质和细胞碎片相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
3．质粒琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。
琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
质粒DNA的提取碱裂解法
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
碱裂解法提取质粒DNA
葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS
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破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
加入溶液Ⅱ之后必须温柔混合，不然基因组DNA会物理断裂；
停留的时间不能过长，因为强碱性条件下基因组DNA会慢慢化学断裂
溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；
SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀
自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDDNA时，多数情况下能看到三条带，按电泳速度由快到慢排序，
分别是 超螺旋带、开环带 和 复制中间体带（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA溶液 I ： 50 mM Glu / 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA （pH 8.0）；重悬菌体，供应缓冲环境。
（pH 很重要）。
葡萄糖：最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，增加粘稠度，削减 摇摆时对DNA 的机械剪切力。
如缺了葡萄糖对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以 说溶液I 中葡萄糖是可缺的。
EDTA ：它是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在分子生物学试剂中的主要作用是抑制 DNase 的活性和抑制微生物生长。
在溶液1中加入高达10 mM 的EDTA,就是要把E.coli 细胞中 的全部二价金属离子都螯合掉。
若不加EDTA,只要是在短时间里完成质粒抽提，也不怕DNA 会快速被降解，由于最终溶解质粒的TE 缓冲液中有EDTA 。
假如哪天你手上正好缺了溶液I,只要用等体积的水，或LB 培育基来悬浮菌体就可以了。
留 意菌体肯定要悬浮匀称，不能有结块。
NaOH ：用新奇的NaOH,是为了保证NaOH 没有汲取空气中的CO2而减弱了碱性。
裂解细 胞的主要是碱，而不是SDS,所以才叫碱法抽提。
NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠 杆菌还是哺乳动物细胞，遇到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双 层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。
用了不新奇的NaOH,即便有SDS 也无法有 效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
只用SDS 也能抽提得到少量质粒，由于SDS 也是弱碱。
加SDS 是为下一步操作做铺垫。
留意：一，时间不能过长,在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会渐渐断裂；二，必需温 顺混合,不然基因组DNA 也会断裂。
溶液III ： 3M KAc∕2M HAc o 加入后就会有大量的沉淀消失，与SDS 的加入有关系。
假如在溶液II 中不加SDS 时也会有很少量的沉淀，明显是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
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质粒DNA的提取（碱裂解法）
实验原理：
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：
1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心
2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥
2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬
浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率
3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万
不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），
使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀
5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL
离心管中
6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小
心将上清吸至新的 1.5mL离心管中
8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新
的 1.5mL离心管中
9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双
链 DNA。
10.4℃下12000rpm离心5min，吸干上清液
11.加70%乙醇1mL，颠倒数次，使质粒悬浮，12000rpm
离心5min。
12.吸干上清液，12000rpm离心1min，吸干乙醇。
室温放
置或超净工作台上风干质粒DNA约10min
13.加20μL灭菌ddH2O或TE缓冲液充分溶解
14.用紫外分光光度计检测其纯度和浓度后置于 -20℃保
存备用。
注意事项：
1.提取过程应尽量保持低温。
提取质粒DNA过程中除去蛋白
很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提
2.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可
使DNA沉淀完全。
沉淀DNA 可用异丙醇(一般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积）
3.6、7、8步骤是抽提蛋白的过程，根据实验要求，可以省
略
4.质粒DNA电泳会有三条带，最远的是线形DNA（lDNA）：质
粒的两条链均断裂，线性分子；中间的是开环DNA （ocDNA）：质粒的一条链断裂，松弛的环状分子；共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂，超螺旋
相关溶液的参考配方:
Solution I
50mmo1／L 葡萄糖
5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷
(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) Solution II
0.4mo1／L NaOH，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用
前等体积混合
Solution III
5mo1／L 醋酸钾 60 mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
相关溶液的作用
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要
溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢
所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。
这一步操作混合均匀后在冰上放
的沉淀并不能将所有的蛋白
的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。
加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。
还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。
而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
异戊醇的添加，主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。