碱裂解法提取dna的方法
第二课 碱裂解法小量提取质粒DNA
实验原理
• 乙醇沉淀 乙醇沉淀DNA
– 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇， 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。 – 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，乙醇可以 消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na离 Na 子能与这些带电基团结合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸 链之间的排斥作用，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。最 常用的盐是醋酸铵／氯化锂／氯化钠／醋酸钠。 – 沉淀体系如果盐浓度高，应在室温下沉淀。放到－20℃，时 间一长反而会导致大量盐的沉淀。 – 为了去除随DNA沉淀的盐，可用70%的乙醇洗涤沉淀。
第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下DNA片断 会慢慢断裂； 第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。
2. 1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表 面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些 蛋白质变性。
实验原理
• 溶液III：醋酸钾溶液，Ph4.8 ：醋酸钾溶液， 溶液
– – 当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值 恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅 速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。 SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高浓 度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均 两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生 的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的 基因组DNA很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。 在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等 缠绕一起被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在 上清夜中。
质粒DNA的提取-碱裂解法实验原理及步骤
实验二质粒DNA的提取－碱裂解法一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。
二、仪器及试剂1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.试剂及配制：LB培养液的配制：酵母浸提物 5.0 g；胰蛋白胨 10.0 g；NaCl 10.0 g；依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH （约0.2 ml）调节培养液的pH值至7.0。
SDS碱裂解法制备质粒DNA
SDS碱裂解法制备质粒DNA步骤（1）挑取转化后的单菌落，接种到2ml的含有适当抗生素的丰富培养基中，37℃振摇培养过夜（培养物的体积小于溶液体积的1/4，否则容器不易盖紧，剧烈振摇培养）（2）收菌，将菌液倒入离心管中，4℃，12500r/min，3min。
（离心后将上清液倒入费废液缸中，倒扣在吸水纸上，若还有液体残留，用移液枪吸出）（3）将细菌沉淀重悬于100μl的预冷的碱性裂解液I（Glu, EDTA, Tris-Hcl）中，涡旋振荡。
（4）加200μl新配置的碱性裂解液II(0.2M NaOH,1%SDS)于每管细菌重悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混合内容物，切勿振荡，将离心管放置在冰上3-5min. （5）加150μl预冷的碱性裂解液III（CH3COOH,CH3COONa），盖紧管口，反复颠倒数次，使得溶液在粘稠度额细菌裂解物中分散均匀。
冰上防止3-5min。
（6）离心（4℃，12000r/min，6min），并将上清转移到另一个离心管中。
（7）在通风橱内加400μl的氯仿：异戊醇（24:1）（8）抽提：将管放在漂浮板上，划8字8min，后离心（4℃，12000r/min,7min），吸取上清液300μl到另一个离心管中。
（9）加无水乙醇600μl，混匀放置在-20℃沉淀15min，后离心（4℃，12000r/min,15min）（10）小心吸去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，加70%乙醇700μl洗涤沉淀，弹起沉淀，浸泡一会，离心（4℃，12000r/min,4min），洗涤两次。
（11）倒掉上清，甩一下，吸去上清，晾干。
（12）TRE溶解（1mlTE，1μlRNA酶）20μl/管。
（13）65℃15min，后4℃冰箱保存。
碱裂解法大量提取质粒DNA
碱裂解法大量提取质粒DNA（同时纯化）准备工作：细菌培养：小量提取质粒DNA鉴定正确后，将菌液以1/50~1/20体积的比例接种到250ml 液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长晚期。
注：培养体积与最终质粒DNA的收获量并无线性关系。
只要培养条件适宜，50ml的培养液有时也可得到总量高达1m g以上的质粒。
操作步骤：1、细菌的收获：将菌液倒入合适的离心管中，8000g离心5分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。
2、将细菌沉淀重悬于10ml溶液Ｉ中。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)注：（1）若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制时间过久，可加入少量溶菌酶；（2）由于沉淀的影响，悬液的体积会达到11~13ml。
3、加15ml溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1%SDS4、加12ml溶液Ⅲ，轻微振荡混匀。
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml5、12000g离心5分种，弃沉淀。
将上清转移到另一离心管中。
6、加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。
12000g离心５分钟，弃上清。
7、沉淀溶解于4~6ml TE中，加入1/50体积RNase A贮存液，颠倒混匀，37℃静置10分钟。
8、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈振荡混匀。
9、4℃12000g离心30秒，将上层液体与少量下层液体转移到另一离心管后，再12000g离心5分种，小心吸取上层液体。
10、加入等体积13％聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/L NaCl混合液，颠倒混匀，冰上静置0.5~2小时。
11、4℃12000g离心10分种，弃上清，DNA沉淀用70%乙醇洗涤。
12、沉淀干燥后，溶解于适量高压灭菌的水中。
注：（1）溶解体积一般为0.2~1ml；（2）此时得到的是已经纯化的质粒DNA，可直接进行各种酶学操作。
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
实验二 碱裂解法抽提质粒DNA-2
实验一、碱裂解法抽提质粒DNA
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在 基因操作中具有重要作用。 质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、 细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。
3、乙醇沉淀：是从水溶液中回收核酸的标准方法。乙醇能够消除核酸的水
化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+之类的平衡离子能够与这 些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因
此，只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇
沉淀。
思考题（质粒抽提）
1、为什么真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提？
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
一、实验目的
1、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用； 2、掌握常用分子生物学试剂的配制；
3、掌握无菌操作技术；
4、掌握大肠杆菌的培养、保存及液体培养物OD值测定的方法； 5、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法；
6、学会根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。
7、离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干（或热板上烘干1 min）。
8、根据DNA沉淀的大小加20~50 l 1× TE 溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育 10分钟（可使DNase失活），之后于 -20 ℃保存备用。
质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及 其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 使用相对过量的试剂 — 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处 是：稳定性好，纯度高，操作更简单。 关注溶液I、溶液II和溶液III的比例！
naoh裂解法提dna
naoh裂解法提dnaNaOH裂解法提取DNADNA是生物体内的重要遗传物质，它携带着生物体的遗传信息。
在科学研究和实验室中，我们常使用NaOH裂解法来提取DNA。
本文将介绍NaOH裂解法的原理和步骤。
一、NaOH裂解法的原理NaOH裂解法是一种常用的DNA提取方法，其原理是利用NaOH的碱性特性和高温作用下，使细胞膜破裂，使DNA从细胞中释放出来。
NaOH的碱性条件以及高温可以使DNA双链断裂，使DNA解旋成单链。
二、NaOH裂解法的步骤1. 准备样本：将待提取DNA的样本收集到离心管中，如细菌培养物、动物组织或植物组织等。
2. 加入NaOH溶液：向离心管中加入适量浓度为0.1-1M的NaOH溶液，使样本完全浸泡在NaOH中。
3. 水浴加热：将离心管放入水浴中，加热至85-100℃，保持一段时间，通常为5-10分钟。
高温和NaOH的碱性条件可以破坏细胞膜和核膜，使DNA从细胞中释放出来。
4. 中和：将离心管取出，加入等体积的中和缓冲液，如三氯乙酸钠（pH≈4.0）或醋酸钠（pH≈5.0），使pH值迅速下降。
中和后，DNA 双链会重新形成。
5. 离心：将离心管放入离心机中，以最大速度离心1-2分钟，将DNA沉淀到离心管底部。
6. 去除上清液：将上清液轻轻倒掉，保留DNA沉淀。
7. 洗涤：加入80%的乙醇溶液，轻轻颠倒离心管，使DNA沉淀与乙醇充分接触，去除杂质。
8. 离心：将离心管放入离心机中，以最大速度离心1-2分钟，去除乙醇溶液。
9. 干燥：将离心管倒置于洁净的工作台上，待DNA干燥后，加入适量的溶剂（如TE缓冲液）重溶。
三、注意事项1. 操作要注意无菌，避免污染。
2. NaOH具有腐蚀性，使用时要注意安全，避免接触皮肤和眼睛。
3. 高温加热时要注意防止样本溢出。
4. DNA的提取量和质量受到多种因素的影响，如细胞类型、样本保存条件等。
通过NaOH裂解法提取DNA是一种简单、快速的方法，适用于大多数生物体的DNA提取。
碱裂解法提取质粒DNA
葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS
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破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
加入溶液Ⅱ之后必须温柔混合，不然基因组DNA会物理断裂；
停留的时间不能过长，因为强碱性条件下基因组DNA会慢慢化学断裂
溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；
SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀
自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDDNA时，多数情况下能看到三条带，按电泳速度由快到慢排序，
分别是 超螺旋带、开环带 和 复制中间体带（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
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碱裂解法提取质粒DNA
实验目的
1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法；
2、了解制备原理及各种试剂的作用。
实验原理
碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
一、材料
含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。
二、设备
微量移液器(20μl，200μl，1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。
三、试剂准备
1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
5. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH 2O至500ml。
4℃保存备用。
6. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH 2O至100ml。
121高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
1M Tris Cl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800ml H 2O中溶解121g Tris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；
0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H 2O中溶解186.1g Na 2EDTA-2H 2O，用10M NaOH调pH8.0(需约50ml)，补H 2O到1L。
7. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
8. 无水乙醇；
9. 70%乙醇；
10. RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris・Cl(pH7.5)，5mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。
冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。
11 灭菌双蒸水ddH 2O
四、操作步骤
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml LB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。
2. 取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp离心1-2min。
弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。
),室温下放置5-10 min。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。
12000rmp离心10min。
溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000rmp离心10min。
（450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。
）
7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，离心12000rmp×10min。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。
注意事项
1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。