姜四倍体离体诱导及其形态学分析
《2024年北京丁香四倍体诱导及其鉴定》范文
《北京丁香四倍体诱导及其鉴定》篇一一、引言北京丁香，作为我国特有的花卉品种，具有极高的观赏价值和生态价值。
近年来，随着生物技术的快速发展，四倍体诱导技术逐渐成为植物育种的重要手段。
四倍体植物因其独特的遗传特性和优良的性状表现，在园艺、农业和医药等领域具有广泛的应用前景。
本文旨在探讨北京丁香四倍体诱导的方法及其鉴定技术，以期为北京丁香的育种和栽培提供理论依据和技术支持。
二、四倍体诱导方法1. 材料准备选择健康、生长良好的北京丁香植株作为实验材料，采集其花蕾和幼叶。
2. 诱导处理采用秋水仙素处理法进行四倍体诱导。
将采集到的花蕾和幼叶用0.01%的秋水仙素溶液浸泡，处理时间根据实际情况进行调整。
处理完毕后，用清水冲洗材料，以去除秋水仙素残留。
3. 培养与分化将处理后的材料置于含有适当激素的培养基中进行培养，促进其发生细胞分裂和分化。
培养条件包括温度、光照、湿度等因素，需严格控制。
4. 继代培养与生根将培养出的丛生芽进行继代培养，直至长出健壮的根系。
在继代培养过程中，需注意观察植株的生长状况，及时调整培养条件。
三、四倍体鉴定技术1. 形态学鉴定观察四倍体北京丁香植株的形态特征，如叶片大小、花型、花色等，与二倍体进行比较，初步判断其倍性。
2. 染色体鉴定采用根尖压片法对四倍体北京丁香植株进行染色体鉴定。
取材后，进行预处理、固定、染色等步骤，观察并计数染色体数目。
通过与二倍体的染色体数目进行比较，确定其倍性。
3. 分子生物学鉴定利用分子生物学技术，如PCR、荧光定量PCR等，检测四倍体北京丁香植株的基因组DNA含量。
通过与二倍体的DNA含量进行比较，进一步确定其倍性。
四、结果与分析1. 四倍体诱导结果经过秋水仙素处理和培养分化，成功获得了北京丁香四倍体植株。
观察其形态特征，发现四倍体植株叶片较大、花型丰满、花色艳丽，与二倍体相比具有明显的优势。
2. 四倍体鉴定结果通过形态学鉴定、染色体鉴定和分子生物学鉴定三种方法，确定了四倍体北京丁香植株的倍性。
1例近四倍体急性髓系白血病的临床特点分析
1例近四倍体急性髓系白血病的临床特点分析朱建锋;王蓓丽;郭玮;潘柏申【摘要】Objective To report a case of near-tetraploidy acute myeloid leukemia(NT-AML),and to analyze its clinical,morphological and cytogenetic characteristics. Methods A case of NT-AML was reported, and its morphology,immunophenotype,treatment and prognosis were evaluated. Morphological characteristics included blast size,irregularity of nuclear contours,cytoplasmic vacuoles,granules and dysplasia. Results This case described acute myeloid leukemia with a near-tetraploid karyotype. Immunophenotype of blasts was consistent with myeloid leukemia phenotype,without expressing lymphoid marker. Blasts were characterized by hyper-granule in cytoplasm,resembling abnormal promyelocytes. It was also showed myelodysplasia-related morphologic changes in myeloid lineages. Conclusions NT-AML occurs in elder males,which exhibits large blast size and is associated with myelodysplasia. It is typically associated with a poor treatment response,low complete remission and short survival. Near-tetraploid karyotype could be used as a sign of poor prognosis with low survival.%目的报道1例近四倍型急性髓系白血病(NT-AML),通过文献复习进一步分析NT-AML的临床、形态学、细胞遗传学特点及预后.方法对1例形态异常的NT-AML从形态学、免疫表型、治疗与预后等方面进行评估.形态特征包括细胞核大小、核形状、胞浆空泡、颗粒和发育不良情况.结果该病例染色体分析显示近四倍体核型.免疫分型符合髓系白血病表型,无淋系抗原表达.形态学上近四倍体原始细胞体积增大,出现胞浆颗粒显著增多,似异常早幼粒细胞.同时粒细胞形态伴有骨髓增生异常相关的改变.结论 NT-AML主要发生于老年男性,常以原始细胞体积增大和骨髓造血发育不良为特点.患者存在造血发育异常及复杂核型,缓解率与生存时间短,近四倍体核型可作为总体生存率不良预后的标志.【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2017(032)007【总页数】4页(P652-655)【关键词】急性髓系白血病;近四倍体核型;形态学特点;预后【作者】朱建锋;王蓓丽;郭玮;潘柏申【作者单位】复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032【正文语种】中文【中图分类】R446.1急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种髓系造血系统肿瘤，世界卫生组织造血和淋巴组织肿瘤分类推荐采用细胞形态学、遗传学、免疫表型、分子生物学来确定AML亚型。
《2024年北京丁香四倍体诱导及其鉴定》范文
《北京丁香四倍体诱导及其鉴定》篇一一、引言北京丁香作为我国特有的珍贵花卉，因其独特的花形和芬芳的香气，备受人们的喜爱。
然而，为了丰富花卉遗传资源的多样性，提高花卉的抗病性和观赏性，四倍体诱导技术被广泛应用于花卉育种中。
本文以北京丁香为研究对象，探讨了四倍体诱导的方法和鉴定技术，旨在为北京丁香育种提供理论依据和技术支持。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的北京丁香材料均来自本地区优质种源。
2. 方法（1）四倍体诱导采用秋水仙素处理法进行四倍体诱导。
首先，选取生长健壮的北京丁香幼苗，将其置于含有不同浓度秋水仙素的溶液中浸泡一定时间。
然后，将处理后的幼苗移至温室内进行培养，观察其生长情况。
（2）染色体鉴定采用根尖压片法进行染色体鉴定。
首先，选取经过四倍体诱导处理的北京丁香幼苗，采集其根尖细胞。
然后，通过固定、染色、压片等步骤，观察并记录染色体数目和形态。
（3）形态学鉴定对经过四倍体诱导处理的北京丁香进行形态学观察，比较其与二倍体在株高、叶片大小、花形、花色等方面的差异。
三、结果与分析1. 四倍体诱导结果通过秋水仙素处理法，成功诱导出北京丁香四倍体。
不同浓度秋水仙素处理后，四倍体的诱导率有所不同。
经过多次试验，我们发现当秋水仙素浓度为0.2%时，处理时间为24小时，诱导效果最佳。
2. 染色体鉴定结果通过根尖压片法，观察到经过四倍体诱导处理的北京丁香染色体数目为正常二倍体的两倍。
染色体形态清晰，无异常变异现象。
3. 形态学鉴定结果与二倍体相比，北京丁香四倍体在株高、叶片大小、花形、花色等方面均有所差异。
四倍体植株普遍较高大，叶片肥厚，花形丰满，花色更加艳丽。
这些形态学特征为四倍体的鉴定提供了有力依据。
四、讨论本实验成功诱导出北京丁香四倍体，并通过染色体鉴定和形态学鉴定进行了验证。
四倍体的成功诱导为北京丁香育种提供了新的遗传资源，有望提高其抗病性、观赏性和遗传多样性。
此外，四倍体的形态学特征也为北京丁香的花卉育种提供了新的思路和方向。
高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究
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预期成果
❖ 〈一〉通过向培养基中加入活性碳等抗氧化剂，防 止外植体褐化。选择激素的最适浓度配比，添加适 宜的生长调节物，如椰汁等，培养出愈伤组织诱导 频率高，再生频率高的植株体系，达到加快繁殖速 度的效果，使蝴蝶兰繁殖成本降低，以提高经济效 益。
❖ 问题二：褐变——外植体切割后，内部细胞与外界 空气直接接触，组织中多酚氧化酶被激活，多酚类 化合物和单宁被氧化后产生醌类物质的缘故。 ①切割面过大，外植体被损伤。②接种方向不对， 应使切割面接触培养基。 ③外植体过于老化。 ④初 代培养中培养基中无机盐和植物生长调节物质浓度 过高。
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1.什么是传统机械按键设计？
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蝴蝶兰种子培养出的试管苗
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第二阶段小结
❖ 完成情况:2,3号种子有根萌发,接着萌发出嫩 黄色的幼叶.而且叶的颜色渐渐转变成绿色.根 毛特别发达,可能和其吸收水分和养料有关.
❖ 存在问题:1号种子目前仍无萌发现象.1号种子 最大,可能是因为接种前1号种子的浸泡时间 不够,所以其萌发也较缓慢.
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进展结果
❖ 茎尖和根尖很容易长霉，而花粉块和花梗节 间很少被污染。褐化的外植体也基本是茎尖 和根尖，因为这些外植体细胞分裂比较活跃， 多酚氧化酶的活性也相对要高些，因此容易 褐化。
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❖ 部分外植体褐变、霉变，其余外植体形 态、颜色与接种前相比无明显变化
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目前存在的问题
❖ 问题一：霉变——①消毒不彻底。 ②超净工作台操 作不严格。 ③无菌操作意识不足。④封装保存不完 善。
四倍体和二倍体西瓜离体组织诱导与耐盐筛选研究
四倍体和二倍体西瓜离体组织诱导与耐盐筛选研究赵璘;刘文革;阎志红;朱红菊【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2016(025)001【摘要】通过离体组织加倍创造四倍体种质是一种快速产生多倍体的方法,为了确认获得的材料为四倍体变异,进行有效的倍性鉴定是不可缺少的.利用二倍体和四倍体西瓜的耐盐性差异,选取生长一致的二倍体和四倍体西瓜子叶再生的不定芽丛,接于含有0、8、10、12、14、16、18、20和22 g/L NaCl的芽诱导培养基中,盐处理30 d后,统计盐害情况和生长状况,并对四倍体西瓜子叶不定芽丛进行分离和筛选,筛选出西瓜离体组织培养过程中最适宜分离二倍体和四倍体西瓜不定芽的盐质量浓度.结果表明:当NaCl质量浓度在14～16 g/L时,可以作为有效分离西瓜二倍体和四倍体,从而最终筛选出大量的能够正常生长发育的四倍体的最适盐质量浓度范围.该研究在西瓜离体组织加倍创造四倍体新种质的技术体系中,可以在早期简单有效地鉴定和筛选西瓜四倍体,加快多倍体西瓜的育种进程.【总页数】6页(P86-91)【作者】赵璘;刘文革;阎志红;朱红菊【作者单位】中国农业科学院郑州果树研究所,郑州450009;北京四中呼和浩特分校,呼和浩特010030;中国农业科学院郑州果树研究所,郑州450009;中国农业科学院郑州果树研究所,郑州450009;中国农业科学院郑州果树研究所,郑州450009【正文语种】中文【中图分类】S651【相关文献】1.耐盐西瓜砧木筛选及其耐盐机理的研究 [J], 张云起;刘世琦;杨凤娟;李东方2.四倍体刺槐试管苗的耐盐筛选 [J], 高凤菊3.四倍体与二倍体西瓜子叶不定芽形态发生过程研究 [J], 赵璘;刘文革;阎志红;谢丽芬4.二倍体马铃薯耐盐材料的离体筛选 [J], 张景云;缪南生;白雅梅;朱珊;吕文河5.诱导二倍体和同源四倍体白菜细胞质雄性不育系不定芽培养基的筛选 [J], 孙敏红;张蜀宁;邓云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物激素调控姜组织培养的研究进展
摘要姜是姜科姜属多年生草本植物,长期采用地下块根无性繁殖,所携带的病毒会导致其产量和品质降低。
通过离体组织培养,不仅可建立姜离体快繁体系,而且通过茎尖组织培养也可实现脱毒苗扩大生产的目的,为生姜生产中存在的产量与质量问题提供解决方法。
关键词姜;组织培养;脱毒;植物激素中图分类号S632.5文献标识码A 文章编号1007-5739(2019)02-0081-01植物激素调控姜组织培养的研究进展徐丝羽王广期何琪刘清波*(湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙410128)基金项目2018年湖南农业大学生物科学技术学院大学生研究性学习和创新性实验计划。
*通信作者收稿日期2018-10-09姜是姜科姜属多年生宿根草本植物,营养丰富,是集调味品、食品加工原料和药用为一体的多用途经济作物[1],其根茎(干姜)、栓皮(姜皮)、叶(姜叶)均可入药。
从西医角度分析,姜对于人和动物的消化系统、循环系统、呼吸系统和中枢神经系统均有作用。
从中医角度分析,姜在开胃健脾、防暑降温、杀菌解毒、止咳祛痰、止呕解酒、缓解腰肩疼痛等方面均有奇效。
在我国,姜的烹饪方法数不胜数,生吃熟做皆有风味。
姜的传统繁殖方法是利用块茎无性繁殖,不仅繁殖速度慢、季节性强,而且由于病毒感染和积累使其品质退化、产量下降[2]。
近年来,利用组织培养技术对姜进行离体培养,不仅提高了其繁殖速度,增加了产量,而且通过茎尖分生组织培养也解决了脱毒提高质量的问题。
1外植体的选择及处理1.1外植体选择各类植物的不同组织对组织培养会产生不同的影响,不同组织所需的植物快繁途径不同[3]。
从杨小丽等[3]、张振霞等[4]、梁称福等[2]的研究可知,姜组织培养的外植体多为幼芽、茎尖、嫩叶、茎段、幼根等部位,其中茎尖分生组织以其毒性低、分裂能力强的特性成为最常用的外植体[5]。
1.2外植体处理接种前要对外植体进行消毒灭菌处理,常用的消毒试剂有酒精、0.1%升汞溶液和10.0%次氯酸钠溶液[6],这3种试剂可以分开使用,也可以自由组合。
生姜二倍体与四倍体 RAPD ISSR 分析
第35卷第2期西南大学学报(自然科学版)2013年2月V o l.35 N o.2J o u r n a l o f S o u t h w e s tU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)F e b. 2013文章编号:16739868(2013)02001505生姜二倍体与四倍体基因组D N A的R A P D和I S S R分析①王志敏,牛义,汤青林,宋明西南大学园艺园林学院,南方山地园艺学教育部重点实验室,重庆市蔬菜学重点实验室,重庆400716摘要:利用R A P D和I S S R标记对生姜二倍体和四倍体的遗传差异进行研究,结果表明:71个R A P D引物和14个I S S R引物对生姜二倍体和四倍体都扩增出了条带,其中有25个R A P D引物和7个I S S R引物在二倍体与四倍体之间扩增出了差异带,并且86%的I S S R引物序列为(G A)或(A G)的简单重复序列.表明在用一定浓度秋水仙素诱导生姜体细胞染色体加倍过程中,会引起基因组D N A的核苷酸碱基序列的改变,并以腺嘌呤和鸟嘌呤组合的简单序列重复区间易形成新的结合位点.关键词:生姜;四倍体;R A P D;I S S R;遗传差异中图分类号:S632.5;Q784文献标志码:A生姜(Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c.)为姜科姜属多年生草本植物,在我国多作一年生栽培.生姜供食用的部分为根状茎,不仅可药食两用,同时还是化工上提取香精㊁姜油酮的原料,在国内外市场上有很大的开发价值[1].常规的生姜栽培主要采用老熟根茎无性繁殖,因而易导致病害的发生.由于多倍体植株具有器官巨大㊁抗病抗逆性强㊁产量高等优势,因此在生姜脱毒[2]㊁脱菌[3]㊁离体快繁[4-6]等研究的基础上,对生姜多倍体的诱导[7-9]㊁形态特征[10]㊁主要生物活性成分变化[11]等方面也开展了一些研究,而对于多倍体生姜基因组D N A特性的研究则鲜有报道.本研究通过R A P D(随机扩增多态性D N A)和I S S R(简单重复序列区间)分子标记对人工诱导的生姜多倍体基因组D N A进行分析,探索在分子水平同源多倍体基因组的变化规律,为多倍体人工诱导体系的完善提供可行的参考,从而为生姜的倍性育种㊁新品种的改良和创新提供科学的依据.1材料与方法1.1试验材料以重庆本地红爪姜为材料,经过茎尖脱菌㊁快繁以及秋水仙素离体诱导(0.2%,8d液体培养基处理),经根尖染色体鉴定为二倍体㊁同源四倍体㊁嵌合体和混倍体的植株[10].1.2D N A的提取采用改良C T A B法[12]提取不同倍性生姜叶片基因组D N A,去R N A后1%琼脂糖凝胶电泳检测其降解情况,用紫外分光光度计测定其吸光度(A),根据A260和A280计算其D N A的浓度和纯度,置于-80ħ冰①收稿日期:20120910基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金项目(X D J K2009C126);教育部博士点基金项目(20090182120003);西南大学博士基金项目(S WU B2007064)资助.作者简介:王志敏(1976),女,山西太原人,博士,副教授,主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究.通信作者:宋明,教授.箱备用.1.3 R A P D -P C R 扩增分析R A P D 引物设计参照高德民的方法[13],共选取107条随机引物.经过优化25μL 反应体系中最佳扩增条件为:2.5μL10ˑP C R R e a c t i o nB u f f e r (200m m o l /L T r i s -H C l ㊁100mm o l /L (N H 4)2S O 4㊁100mm o l /L K C l ㊁20mm o l /L M g C l 2㊁1%T r i t o nX -100,p H 为8.8),0.4mm o l /Ld N T P s ,10p m o l /μL 引物,20n g D N A 模板,1U T a g DN A 聚合酶,超纯水补至25μL .扩增程序为:94ħ预变性1m i n ,36ħ退火2m i n ,72ħ延伸2m i n ,5个循环;94ħ30s ,36ħ1m i n ,72ħ2m i n ,40个循环;72ħ延伸5m i n ,4ħ保存.扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶(内含1μg /m LE B )110V 电压下电泳检测,U V 成像系统照相保存.1.4 I S S R -P C R 扩增分析引物设计参照加拿大哥伦比亚大学设计的一套#9系列引物[14].25μL 反应体系中最佳扩增条件为:2.5μL10ˑP C R R e a c t i o nB u f f e r ㊁0.4mm o l /Ld N T P s ㊁10p m o l /μL 引物㊁20n g D N A 模板㊁1U T a g D N A 聚合酶㊁0.5μL 甲酰胺,超纯水补至25μL .P C R 扩增程序为:94ħ5m i n ,94ħ45s ,50~55ħ1.5m i n ,72ħ延伸1.5m i n ,35个循环;72ħ延伸7m i n ,4ħ保存.扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,U V 成像系统观察照相.所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,其它试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司.M :L a m b d aD N A ∕E c o R I +H i n d Ⅲ;D :二倍体;T :四倍体;M I :混倍体;S:嵌合体.图1 不同倍性生姜基因组D N A2 结果与分析2.1 D N A 的检测采用改良C T A B 法提取的生姜基因组D N A 如图1所示,每个样品的基因组D N A 条带清晰㊁完整性好㊁无拖尾㊁无降解㊁纯度较高.吸光度检测A 260/A 280比值为1.82,说明基本上没有蛋白质㊁多糖和R N A 的污染,完全满足后续实验的要求.2.2 基因组D N A 的R A P D 分析选用的107条R A P D 随机引物中有71条在生姜二倍体和同源四倍体中都扩增出了条带,共计461条(大小约100~3000b p ),每个引物平均扩增6.51条;其中有46条引物在二倍体和四倍体中扩增条带相同(图2-A ),25条引物(表1)扩增出了差异条带(图2-B ),占全部引物的23%.表1 扩增出差异带的R A P D 引物序列引物编号序列(5 t o 3)引物编号序列(5 t o 3)S 29G G G T A A C G C C S 117C A C T C T C C T CS 61T T C G A G C C A G S 119C T G A C C A G C CS 65G A T G A C C G C CS 140G G T C T A G A G G S 82G G C A C T G A G G S 143C C A G A T G C A C S 84A G C G T G T C T GS 144G T G A C A T G C C S 85C T G A G A C G G A S 146A A G A C C C C T C S 93C T C T C C G C C A S 149C T T C A C C C G AS 95A C T G G G A C T C S 150C A C C A G G T G A S 96A G C G T C C T C C S 154T G C G G C T G A G S 97A C G A C C G A C A S 157C T A C T G C C G T S 103A G A C G T C C A CS 159A C G G C G T A T GS 105A G T C G T C C C C S 164C C G C C T A G T CS 109T G T A G C T G G G2西南大学学报(自然科学版) h t t p ://x b b jb .s w u .c n 第35卷M :G e n e R u l e r T M 100b pD N AL a d d e rP l u s ;D :二倍体;T :四倍体.图2 生姜二倍体与四倍体R A P D 扩增结果对不同倍性生姜进行R A P D 扩增后发现,经引物S 95扩增后四倍体的条带与嵌合体和混倍体相同而与二倍体有差异;引物S 85㊁S 84扩增后二倍体的条带与嵌合体㊁混倍体相同而与四倍体有差异;而引物S 79㊁S 61扩增后二倍体㊁四倍体㊁嵌合体和混倍体之间扩增的D N A 条带都不完全相同(图3).说明在用秋水仙素诱导体细胞加倍时,由于细胞状态不同造成染色体加倍非同步化,同时可能存在染色体的断裂㊁易位等情况,因此在R A P D 扩增时出现二倍体㊁四倍体与嵌合体㊁混倍体既有相同的结合位点也有各自不同的结合位点.D :二倍体;S :嵌合体;M I :混倍体;T :四倍体.图3 不同倍性生姜R A P D 扩增结果2.3 基因组D N A 的I S S R 分析选用的14条I S S R 引物中有7条(表2)在生姜二倍体和同源四倍体中扩增出了差异带,每个引物扩增的D N A 条带数在3~10条之间,共计97条(大小约200~2500b p),每个引物平均扩增6.93条(图4).这7条引物中有86%的引物序列为(G A )或(A G )的简单重复序列,说明生姜体细胞在经秋水仙素诱导时,以腺嘌呤和鸟嘌呤组合的简单序列重复区间易形成新的结合位点.用产生多态性的引物对二倍体㊁四倍体㊁嵌合体和混倍体进行扩增,引物811扩增后二倍体的扩增条带与嵌合体的相同,而混倍体与四倍体的相同;引物840扩增后,四倍体与嵌合体㊁混倍体的扩增条带相同,而与二倍体的差异明显;而引物841扩增后二倍体㊁四倍体㊁嵌合体和混倍体的扩增条带都不完全相同(图5).表2 扩增出差异带的I S S R 引物序列引物编号引物序列(5 t o 3)引物编号引物序列(5 t o 3)811G A G A G A G A G A G A G A G A C841G A G A G A G A G A G A G A G A Y C834A G A G A G A G A G A G A G A G Y T 836A G A G A G A G A G A G A G A G Y A 835A G A G A G A G A G A G A G A G Y C824T C TC T CT C TC T CT C TC g840G A G A G A G A G A G A G A G A Y T 3第2期 王志敏,等:生姜二倍体与四倍体基因组D N A 的R A P D 和I S S R 分析M :G e n e R u l e r T M 100b p DN AL a d d e rP l u s ;D :二倍体;T :四倍体.图4 生姜二倍体与四倍体I S S R扩增结果M :G e n e R u l e r T M 100b p DN AL a d d e rP l u s ;D :二倍体;T :四倍体;M I :混倍体;S:嵌合体.图5 不同倍性生姜I S S R 扩增结果3 讨论与结论对于无性繁殖植物,多倍体育种是实现优质高产育种的重要途径之一.生姜作为重要的药食两用作物,由于不能利用有性繁殖进行育种,只能靠少数品种长期无性繁殖,因此研究者试图通过多倍体诱导获得生姜新种质.通过采用化学诱导剂秋水仙素处理获得了一些同源四倍体生姜材料[7-10],其中秋水仙素浓度和时间的筛选是诱变成功的关键.本研究前期得到0.2%秋水仙素处理8d 的组合获得了较高的四倍体诱导率和成活率[10].但在辣椒多倍体诱导中发现秋水仙素不仅会促使细胞内染色体数目增加,还会引起染色体结构的变异[15].王卓伟㊁刘文革等通过A F L P 分析发现,经秋水仙素诱变得到的同源4x 与2x 相比,在D N A 分子遗传结构上产生了一定程度的改变[16-17].金鱼草二倍体和同源四倍体的R A P D 分析也表明D N A 差异表现在图谱的消失或增加上[18].本研究通过R A P D 和I S S R 标记分析,得到的生姜四倍体与二倍体在D N A 水平也表现出了一定的差异,说明在诱导生姜体细胞染色体加倍时,可能引起了基因组D N A 核苷酸碱基序列的改变,I S S R 分析发现,以腺嘌呤和鸟嘌呤组合的重复序列区间较易形成新的结合位点.试验中两种分子标记比较,R A P D 标记操作简单,无需专门设计引物,但易受反应条件的影响,重复性差,而I S S R 标记由于引物长度在17~24b p ,退火温度较高,与模板结合的强度提高,实验结果的可重复性高,并且在理论上检测区域可覆盖整个基因组,扩增的结果能较全面反映群体的变异,因此较适用于对倍性育种中基因组D N A的检测及诱导体系的评价.彭海等认为人工诱变中使用的秋水仙素以及加倍后组织培养与植株再生过程都难免在基因组上引入突变,这些变异可在D N A 结构和基因表达等方面表现出来,从而干扰倍性效应研究的准确性[19],H a n 等研究发现组织培养可激活逆转座子T o s 17[20].对于生姜离体诱导获得的四倍体和二倍体基因组D N A 的多态性是D N A 核苷酸碱基序列的位点改变造成的,还是离体培养条件下其他因素引起,以及如何减少变异完善多倍体诱导体系,还在进一步研究中.参考文献:[1]王志敏,牛 义,汤青林,等.多效唑对生姜试管苗生理特性的影响[J ].西南大学学报:自然科学版,2009,31(10):39-42.[2] 高山林,卞云云,陈柏君.生姜组织培养脱病毒㊁快繁和高产栽培[J ].中国蔬菜,1999(3):40-41.[3] 郭启高,宋 明,梁国鲁.生姜脱菌及离体快繁研究[J ].西南农业大学学报,1999,21(2):137-139.[4] HO S O K IT ,S A G AWA Y.C l o n a lP r o p a g a t i o no fG 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s s i o nT r a n s po s e s I n t oG e n e sa n d C a u s e sS t r u c t u r a la n d M e t h y l a t i o n A l t e r a t i o n so faF l a n k i n g G e n o m i c R e g i o n [J ].H e r e d i t y,2004,141(3):243-251.R A P Da n d I S S RA n a l ys e s o fG e n o m i cD N Ao f D i p l o i d a n dA u t o t e t r a pl o i d Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c o e WA N GZ h i -m i n , N I U Y i , T A N G Q i n g -l i n , S O N G M i n g S c h o o l o f H o r t i c u l t u r ea n dL a n d s c a p eA r c h i t e c t u r e ,K e y L a b o r a t o r y o f H o r t i c u l t u r eS c i e n c e f o r S o u t h e r nM o u n t a i n o u sR e g i o n s ,M i n i s t r y o f E d u c a t i o n ,K e y L a b i nO l e r i c u l t u r eo f C h o n g q i n g ,S o u t h w e s t U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400716,C h i n a A b s t r a c t :R A P D (r a n d o m l y a m p l i f i e d p o l y m o r p h i cD N A )a n d I S S R (i n t e r -s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s )m o l e c -u l a rm a r k e r sw e r eu s e d t o a n a l y z e t h e g e n o m i cD N Ao f d i p l o i d a n d a u t o t e t r a p l o i d g i n g e r (Z i n g i b e r o f f i c i -n a l e R o s c o e )i n d u c e db y c o l c h i c i n e s .O f t h e 10710-b a s i c p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y ,71a m pl i f i e db a n d s o f d i p l o i da n d a u t o t e t r a p l o i d g i n g e r ,25R A P D p r i m e r s a n d 7I S S R p r i m e r s a m p l i f i e d d i f f e r e n t b a n d s b e t w e e n d i p l o i da n d a u t o t e t r a p l o i d g i n g e r ,a n d 86p e r c e n t o f I S S R p r i m e r sw e r e s i m p l e s e q u e n c e r e pe a t s o fG Aa n d A G.T h e a b o v e r e s u l t s s h o w e dt h a t i nt h e p r o c e s sof c h r o m o s o m ed o u b l i ng o f g i n ge r s o m a t i cc e l l sw i t h c o l c h i c i n e s ,D N A m o l e c u l a r s t r u c t u r e ,i .e .t h en u c l e o t i d e s e q u e n c eof i t sg e n o m i cD N A ,m i gh t c h a n g e ,a n d si m p l e s e q u e n c e r e p e a t s a b o u n d e dw i t hc o m b i n a t i o no f a d e n i n e a n d g u a n i n ew e r em o r e l i k e l y t o f o r m n e wc r o s s -l o c a t i o n s .K e y wo r d s :Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c o e ;a u t o t e t r a p l o i d ;r a n d o m l y a m p l i f i e d p o l y m o r p h i cD N A (R A P D );i n t e r -s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t (I S S R );g e n e t i c d i f f e r e n c e 责任编辑 欧 宾5第2期 王志敏,等:生姜二倍体与四倍体基因组D N A 的R A P D 和I S S R 分析6西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第35卷。
生姜醇提取物诱导TM_4细胞凋亡的研究_王庆忠
潍坊学院学报 ２ ０ １ 大 ， 这 种 抑 制 作 用 越 来 越 强， 呈 剂 量 间 依 赖 性。 处 理 浓 度 达 到 １ ０ ０ ｍ Ｌ 时， ｇ μ ＴＭ４ 细胞的生长与增殖已被基本抑制 。
— ６ ０ —
第 ４ 期 王庆忠 ： 生姜醇提取物诱导 ＴＭ４ 细胞凋亡的研究
／ 残渣 ， 浸提液置于 ６ 并配制成 ０ ５℃ 干燥箱中烘干 。 称重浸出物 ， ． １ ｍ ｍ ｌ的母液 。 ｇ １ ． ４ ＭＴ Ｔ 比色法检测 ＴＭ４ 细胞活性 ， 而死细 ＭＴ Ｔ 能被活细胞线粒体中的琥珀酸 脱 氢 酶 还 原 为 水 不 溶 性 的 蓝 紫 色 结 晶 甲 瓒 （ Ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｚ ａ ｎ） 胞无此功能 。ＤＭＳ 用酶标仪在４ 可 间 接 反 映 活 细 胞 数 量。 Ｏ 能溶解甲瓒 ， ９ ０ ｎ ｍ 波 长 处 测 定 其 光 吸 收 值， 在一定细胞数范围内 ， ＭＴ Ｔ 结晶形成的量与细胞数成正比 。
） 表 １ ＭＴ Ｔ 法检测各浓度生姜醇提取物对 ＴＭ４ 细胞增殖的影响 （ ±Ｓ 组别 ／ 剂量 （ ｍ Ｌ） Μ μ 抑制率 对照组 ０ ． ０ １ ． ２ ９±０ ． ０ ３ ２ ０ ４ ０ Ｃ ＣＭ 处理组 ６ ０ ３ ７ ． ７±０ ． １＊ ８ ０ ５ １ ． ２±０ ． １＊ １ ０ ０ ７ ４ ． ６±０ ． １ １＊
第１ ２ 卷第 ４ 期 潍坊学院学报 Ｖ ｏ ｌ ． １ ２Ｎ ｏ ． ４ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｗ ｅ ｉ ｆ ａ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｕ ． ２ ０ １ ２ ２ ０ １ ２ 年 ８ 月 Ｊ Ａ ｇ ｙ ｇ
生姜醇提取物诱导 ＴＭ４ 细胞凋亡的研究
２ 王庆忠１，
＊
（ ； ） 山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室 ，山东 潍坊 潍坊学院，山东 潍坊 １ ． ２ ６ １ ０ ６ １ ２ ． ２ ６ １ ０ ６ １ 摘 要： 生姜醇提取物的应用已引起了广泛的关注 ， 特别是在医药方面得到了人们的高度重视 。 本研 究主要探讨生姜醇提取物对支持细胞系 ＴＭ４ 体 外 生 长 的 影 响 。 通 过 采 用 形 态 学 观 察 、 ＭＴ Ｔ 法 和 ＴＵＮ － Ｎ Ｅ Ｌ 法检测 ５ 个不同浓度的生姜醇 提 取 物 对 小 鼠 支 持 细 胞 株 ＴＭ４ 细 胞 生 长 和 增 殖 的 作 用 。 结 果 表 明 ， ／ 生姜醇提取物抑制 ＴＭ４ 细胞的增殖并诱导其细胞凋亡 ， 这种作用呈剂量依赖效应 ， 当用 ４ ０ ｍ Ｌ 的生 μＭ 姜醇提取物处理培养的 ＴＭ４ 细胞 时 ， ＭＴ Ｔ 法测得的细胞生长抑制率和 Ｔ Ｅ ＮＮ Ｅ Ｌ 法获得的细胞凋亡指 数与对照组相比均有显著差异 。 这些结果说明 ， 生姜醇提取物在预防和治疗睾丸癌方面有应用价值 。 关键词 ： 生姜醇提取物 ； 细胞凋亡 ＴＭ４ 细胞 ； （ ） 中图分类号 ： Ｒ ７ ３ ４ ． ２ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ １－４ ２ ８ ８ ２ ０ １ ２ ０ ４－０ ０ ６ ０－０ ４ ） 生姜 （ 是药食同源植物 ， 具有驱风散寒 、 健胃止吐 、 抑菌杀 虫 、 抗 肿 瘤 等 作 用。生 姜 Ｚ ｉ ｎ ｉ ｂ ｅ ｒ ｏ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｅ ｇ ， 醇提取物 （ 含姜黄素等多种物质 ， 其中的姜黄素为姜的重要 Ｚ ｉ ｎ ｉ ｂ ｅ ｒ ｏ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｅ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ａ ｌ ｃ ｏ ｈ ｏ ｌ Ｃ ＣＭ） ｇ 广泛用于食品添加剂和着色剂 ， 具有抗 Ｈ 抗利什曼原虫 、 抗细胞畸变 、 抑制血小板聚集 活性成分之一 ， Ｉ Ｖ、 ［ ］ １－２ 。 尤其是生 姜 醇 提 取 物 的 抗 癌 活 性 在 近 年 来 受 到 广 泛 重 视 。 研 究 表 明 ， 和血栓形成等多种作用 生姜 醇提取物可诱 导 细 胞 凋 亡 ， 对 宫 颈 癌、 子 宫 内 膜 癌、 肾 癌、 乳腺癌等各种癌症的发生有抑制和治疗作
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姜四倍体离体诱导及其形态学分析
王志敏 牛 义 宋 明 3 汤青林
(西南大学园艺园林学院 , 重庆市蔬菜学重点实验室 , 重庆 400716)
摘 要 : 以丛生芽为材料 , 在离体培养条件下比较了秋水仙素不同浓度 、不同处理时间诱导姜体细胞染 色体加倍的效果 。结果表明 : 以 0120 %秋水仙素液体培养基处理 8 d的诱导效果最好 , 诱变率和成活率分别 达到了 42186 %和 70100 % 。根尖染色体压片检查发现 , 四倍体染色体数为 2n = 4x = 44, 二倍体对照为 2n = 2x = 22。四倍体与二倍体相比表现出植株高大 , 茎秆变粗 , 叶片长 、宽 、厚均增大 , 叶片下表皮气孔密度减 小 , 气孔和保卫细胞增大 , 保卫细胞内叶绿体数增加等特征 , 其中气孔密度及保卫细胞内的叶绿体数可作为 鉴别四倍体与二倍体的重要性状 。
1 材料与方法
试验于 2007年 3月 ～2009年 2月在西南大学进行 。 111 试验材料
以重庆本地红爪姜 (由重庆市蔬菜学重点实验室提供 ) 离体诱导的丛生芽的茎尖为试材 。 112 试验方法 11211 四倍体的诱导 采用液体培养方式 , 将在固体培养基上生长旺盛的姜丛生芽块 (含 5 ～ 6 个芽 ) 转接到 M S + 6 - BA 310 m g·L - 1 + NAA 011 m g·L - 1 +蔗 糖 30 g·L - 1 、 pH 值 518 ～ 610, 且分别添加不同浓度 ( 0101 %、0105 %、0110 %、0120 % ) 秋水仙素的液体增殖培养 基 (每瓶 35 ～40 mL ) 中 , 黑暗 培 养 , 每 天 早 晚 各 轻 轻 摇 动 培 养 基 1 次 。分 别 处 理 2、 4、 6、 8、 12、 16 d后取出 , 在无菌条件下用无菌水冲洗 3 ～4 次 , 然后用无菌滤纸吸干表面水分 , 接 种到不含秋水仙素的 M S + 6 - BA 310 m g·L - 1 + NAA 011 m g·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +卡拉胶 7 g·L - 1 、 pH 值 518 ～610 的固体增殖培养基上 , 培养 1 个月后统计丛生芽块的成活率 、增殖等 情况 。 11212 四倍体的鉴定 采用观察诱导处理后再生植株的形态特征及根尖细胞染色体计数相结合的 方法 , 判断植株的倍性 。
素液体培养基中的处理情况见表 1。随着秋水仙素浓度升高和处理时间延长 , 丛生芽成活率和 增殖率呈下降趋势 。从诱变效果看 , 0101 % ～0120 %的秋水仙素对姜丛生芽生长点的诱导均 有效果 , 当秋水仙素浓度为 0101 % 、 0105 % 、 0110 %时 , 随着处理时间的延长 , 丛生芽诱变 率增高 ; 浓度为 0120 %时 , 随着处理时间的延长 , 诱变率呈现先增后减的趋势 , 在处理 8、 12 d时诱变率都极显著高于其他处理 , 且两处理在成活率上表现出极显著差异 。综合考虑 24 个处 理组合 , 以 0120 %秋仙水素液体培养基处理 8 d的效果最好 , 诱变率和成活率分别达到了 42186 %和 7010 % 。
2010 (4)
王志敏等 : 姜四倍体离体诱导及其形态学分析
43
体 , 随机统计 30个保卫细胞的叶绿体数 , 求其平均值 。 11214 数据分析 试验数据采用 D PS统计软件以 D uncanπs新复极差法进行多重比较 。
2 结果与分析
211 四倍体的诱导 浸泡处理是秋水仙素对外植体作用最为直接的一种方法 , 丛生芽浸泡在不同浓度的秋水仙
Key words: Z ing iber officina le Ro scoe1; In vitro; Po lyp lo id; Mo rp ho logy
姜 ( Z ing iber off icina le Ro scoe1 ) 古名薑 , 别名生姜 、黄姜 , 为姜科姜 属 多 年 生 草 本 植 物 , 因长期无性繁殖 , 导致种 质 退 化 、产 量 降 低 , 严 重 制 约 了 姜 的 生 产 和 发 展 (金 波 , 1997 ) 。
染色体计数方法 : 在无菌条件下切取生长旺盛的根尖 015 ～110 cm 长 →对二氯苯饱和溶液预 处理 315～410 h→蒸馏水清洗 →卡诺氏固定液 (无水乙醇 ∶冰醋酸 = 3 ∶1) 在 4 ℃条件下固定 24 h→蒸馏水清洗 →1 mol·L - 1盐酸溶液 60 ℃水浴条件下解离 15 ～20 m in→蒸馏水清洗 →在载玻片 上切取根尖分生组织 (前端乳白色部位 ) →改良卡宝品红染色 →用尖头镊子夹碎根尖 →压片后用 铅笔敲散细胞团 →镜检 →摄像 。 11213 四倍体与二倍体植株形态与气孔特征比较 对组培苗期 (移出试管 7 ～15 d) 、旺盛生长 时期 (从三股杈至收获 ) 的姜四倍体及二倍体植株的株高 、茎粗 、叶片长和宽以及叶片厚等形态 指标进行测定比较 , 其中叶片的长 、宽和株高用直尺或盒尺测量 , 叶片厚和茎粗用游标卡尺测量 , 每个样品测量 10株 。
保卫细胞叶绿体数测定 : 取二倍体和四倍体植株的全展叶片下表皮 , 加一小滴 1 % I - K I溶 液染色 , 加盖玻片 , 叶绿体呈黑色 , 在油镜 ( ×1 000 ) 下观察气孔保卫细胞 (两个 ) 内的叶绿
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关键词 : 姜 ; 离体培养 ; 多倍体 ; 形态学 中图分类号 : S63215 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 26346 ( 2010) 04 20041 206
Tetraplo id of Z in g ibe r off i t and Its M or2 phology Ana lysis
WAN G Zhi2m in, N IU Yi, SON G M ing3 , TAN G Q ing2lin
( College of Horticu ltu re and L andscape A rch itectu re, S ou thw est U n iversity, Key L ab in O lericu ltu re of Chongqing, Chongqing 400716, Ch ina)
Abstract: Tak ing clu ste ring ginge r ( Z ing iber officina le Ro scoe1 ) shoo t as m aterials, we comp ared the doub ling effects of its som a tic cell ch romo som e unde r in vitro cu ltivation cond ition and w ith d ifferen t co lch ic ine s concen tra tion and d iffe ren t treating tim e p eriod. The resu lts showed that the inducem en t effec t was the be st, when shoo ts were trea ted in liqu id cu ltu re m ed ium of 012 % co lch ic ine s concen tra2 tion fo r 8 days. The inducem en t and su rvival rate were 42186 % and 70100 % , resp ective ly. The ch romo som e num ber of tetrap lo id was 2 n = 4 x = 44 , wh ile that of the con tro l d ip lo id was 2 n = 2 x = 22. Comp ared w ith d ip lo id, tetrap lo id showed characteristic s of ta ller p lan t he igh t, th icker stem , la rge r, b roader and th icker leaf b lade, fewer stom ata p er un it area, larger stom ata, and mo re ch lo rop lasts in stom a ta gua rd cell. The stom ata den sity and ch lo rop last num ber in gua rd cells cou ld be impo rtan t charac2 te ristics d istingu ish ing tetrap lo id from d ip lo id.
气孔特征观察 : 分别取姜四倍体和二倍体组培苗及定植苗的全展叶片 , 用尖嘴镊子撕下表皮 , 置于载玻片上 , 加一小滴 1 % I - K I溶液染色 , 盖上盖玻片 , 在目镜带测微尺的普通显微镜下随 机测量 10个气孔以及保卫细胞的长度与宽度 ( ×400 ) , 取 3 个视野测定气孔密度 ( ×150 ) , 并 在 O lympus显微镜下摄像 , 每个样品测定 3片叶 , 每片叶 3次重复 。
收稿日期 : 2009 209 218; 接受日期 : 2009 210 221 基金项目 : 西南大学博士基金项目 (20710904) 作者简介 : 王志敏 , 博士 , 副教授 , 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术 , E2mail: m inzniwang_ 555@1631com
3 通讯作者 (Corresponding author) : 宋明 , 教授 , 硕士生导师 , 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术 , E2mail: swauso2 ngm @ yahoo1com1cn