干细胞在男性不育领域的研究进展

Nayernia等［7］报 道 通 过 一 种 新 的 以 启 动子为基础的顺序选择的策略在体外从 多分化潜能的畸胎瘤细胞中产生生殖细 胞 系 （SSC1），并 且 显 示 SSC1 细 胞 形 成 成 熟的曲细精管结构， 将其移植入受体睾 丸 后 支 持 生 精 作 用 。 此 外 ，Nayernia 等 ［8］ 还 在 2006 年 从 胚 胎 干 细 胞 中 建 立 了 精 原干细胞系， 将其注入鼠卵母细胞浆后 可正常受精， 尽管出生小鼠在形态大小 及生存期上与正常小鼠有一定差别，但 仍然表明从胚胎干细胞体外衍生的雄性 配子可正常受精并发育成个体。 第一次 表明胚胎干细胞来源的生殖细胞能够产 生子代老鼠。
干细胞通常存在一个由周围细胞所 形成的特定环境中， 并受到这个环境的 影响， 我们把这个环境称为这种干细胞 的 微 环 境 ，又 称 Niche。 Kauatsu 等 将 ［13］ 不 孕的白色斑点鼠中提取的健康支持细胞 植 入 有 支 持 细 胞 缺 陷 的 不 孕 Steel（S1）小 鼠 睾 丸 的 曲 细 精 管 中 ， 在 受 体 睾 丸 S1 干 细胞发生生精过程。 平均 1．1％的受体小 管显示精子发生过程。 此外用睾丸组织 中培养的生殖细胞做受精试验可以在 114 例 成 功 注 射 的 卵 母 细 胞 中 获 得 4 个 正常的子代。 研究表明可以通过支持细 胞移植的方法来纠正雄性生殖系微环境 缺陷的问题。 尽管需要进一步改善精子 发 生 过 程 效 率 低 的 问 题 ，但 通 过 Niche 移 植来改变环境缺陷对治疗自我更新组织 不 可 治 愈 的 紊 乱 提 供 了 新 的 策 略 。 Ryu 等 ［14］2006 年 报 道 年 龄 因 素 会 导 致 干 细 胞 和 （或 ）Niche 功 能 不 可 弥 补 的 缺 陷 。
个结果提升了使用骨髓来源的干细胞治 疗男性不育和睾酮缺乏的可能性。
但 最 近 Lassalle 等 ［22］ 报 道 骨 髓 来 源 的干细胞在体内不能重建精子发生过 程。 体内在维甲酸存在的情况下，小鼠成 熟骨髓间充质干细胞能够表达生殖细胞 标志， 但把它们移植到睾丸后并没有经 历精子发生过程。 数据提示骨髓来源的 干细胞并不能转分化产生生殖细胞，产 生减数分裂后的单倍体细胞， 没有在受 体睾丸组织中发现细胞集落现象。 运用 流式细胞仪分析受体睾丸组织的单细胞 悬液发现， 全部骨髓中仅包含很少的 EGFP 阳 性 细 胞 ，因 此 作 者 认 为 把 骨 髓 来 源的干细胞移植入成熟小鼠的睾丸后， 并不会经历精子发生过程。 2 展望
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实 用 医 学 杂 志 2009 年 第 25 卷 第 14 期
干细胞在男性不育领域的研究进展
徐宁儒 曹蓓 刘春晓
世界卫生组织对男性不育的定义是： 夫妇同居一年以上， 未用任何避孕措施， 由于男方因素造成的女方不孕。 据报道， 世 界 范 围 内 约 有 15％ ～ 20％的 育 龄 夫 妇 不 能 生 育［1］。 传 统 的 男 性 不 育 治 疗 主 要 包 括药物治疗，手术治疗和辅助生殖技术治 疗。 近年来由于干细胞的再生潜力，使它 成为治疗男性不育等退行性疾病的理想 手段，本文主要对最近几年干细胞在男性 不育领域的研究进展作一综述。 1 干细胞在男性不育中的研究进展 1．1 干细胞向生殖细胞的转化及精原干 细 胞 的 增 殖 分 化 2003 年 Toyooka 等 ［2］ 将 绿 色 荧 光 蛋 白 ∕LacZ 表 达 内 生 性 鼠 脉 管同源物基因敲入胚胎干细胞， 研究发 现随着胚胎体形成， 胚胎干细胞在体外 可分化成内生性鼠脉管同源物阳性生殖 细 胞 ，细 胞 表 达 GFP， LacZ 也 表 达 VASA 同系物，暗示它们分化成生殖干细胞，这 些细胞在 5 ～ 7 d 的胚体中可以清晰地观 察到。 它们的浓度在接触滋养外胚层细 胞分泌的骨形成蛋白 4 后增加， 将这些 阳性细胞移植入成年小鼠的睾丸时，可 参与精子发生。 说明胚胎干细胞在体外 可分化为原始生殖细胞， 这些衍生的生 殖细胞可迁移入胎儿生殖腺， 并具有减 数分裂及产生精子的能力。
Kubota 等 ［6］在 试 验 中 用 无 血 清 培 养 和对精原干细胞的移植试验来鉴定外源 性可溶性因子对于促进精原干细胞增殖 的作用。 在神经胶质细胞来源的神经营 养 因 子 存 在 的 条 件 下 ，从 DBA ／ 2J 系 血 统 的 小 鼠 中 获 得 的 SSCs 形 成 填 充 浓 密 的 细胞团块并继续增殖， 有功能的移植试 验证明这些浓密的细胞团块确实是精原 干 细 胞 。 因 此 ，GDNF 诱 导 的 细 胞 信 号 在 精原干细胞自我更新的过程中起关键作 用 。 平 均 5．6 d 培 养 的 SSCs 的 数 量 就 会 翻 倍 ， 这 些 团 块 细 胞 高 度 表 达 OCT-4，将 精原干细胞移入受体睾丸中精原干细胞 增殖超过 6 个月，重建了精子发生过程， 恢复了不孕受体的生育能力。
如 同 Toyooka 等 一 样 ，Geijsen 等 ［3］诱 导胚胎干细胞先形成胚胎体， 随后证实 在胚胎体中存在并可分离出原始生殖细 胞 ， 这 些 细 胞 在 培 养 过 程 中 出 现 lgf2r， H19 基 因 的 甲 基 化 标 记 的 消 退 ， 这 是 生 殖细胞系一个特有特征， 说明胚胎体衍 生的原始生殖细胞发育为能表达典型成 熟精子基因的单倍体雄性配子， 将单个 雄性配子细胞穿刺入卵母细胞浆内后可 受精，其中 1 ／ 5 受精卵能发育至囊胚期。
Shinohara 等 ［12］的 研 究 显 示 显 示 了 支 持细胞移植的可行性，将供体睾丸组织中 分离出的支持细胞通过显微注射法使其 定居在不孕受体睾丸的曲细精管上，当 受体的支持细胞通过镉治疗被消除或者 供者支持细胞来源于未成熟的睾丸时， 集落活力明显增强， 移植后分裂的供体 细胞重新聚合形成曲细精管样结构，在 受体睾丸中也可检测到精子发生过程。
Kanatsu－Shinohara 等 ［18］ 在 体 外 将 含 有增强绿色荧光标记物和抗药基因的质 粒载体对精原干细胞进行转染。 通过体 外药物选择分离出稳定的经过转染的干 细胞克隆。 将精原细胞移植入不孕的受 体中， 这些干细胞克隆被扩增并产生转 基 因 的 孕 体 ， 后 代 平 均 有 49％携 带 转 基 因，移植 1 年后，这些受体小鼠继续产生 单克隆的转基因孕体。 因此，以成体细胞 为基础的基因方法能够起到类似胚胎干 细胞的方式来改变和选择精原干细胞克 隆。 使用新生的精原干细胞进行基因选 择调控的可行性表明精原干细胞广泛的 增殖能力， 提供了产生稳定的转基因动 物和种系基因治疗的新方法。 1．3 骨 髓 来 源 的 干 细 胞 与 男 性 不 育 2006 年 Nayernia 等 ［19］首 次 证 实 鼠 类 的 骨 髓来源的干细胞能够分化为雄性生殖细 胞 。 2007 年 Drusenheimer 等 ［20］从 骨 髓 来 源的干细胞中获得人雄性生殖细胞。
Hubner 等 ［4］ 用 带 限 定 的 生 殖 细 胞 OCT3 ／ 4 和 GFP 标 记 的 胚 胎 干 细 胞 来 进 行研究， 这些细胞在普通胚胎干细胞培 养皿中培养，4 d 后， 生殖细胞特 异 性 的 OCT3 ／ 4 在 一 些 细 胞 中 被 检 测 到 ，培 养 后
作者单位：510280 广州市，南方医科大学 珠 江 医 院 泌 尿 外 科 （徐 宁 儒 ， 刘 春 晓 ）；510515
Lue 等 ［21］ 将 标 记 有 绿 色 荧 光 蛋 白 转 基因成年小鼠的骨髓细胞注射入用白消 安 处 理 的 野 生 型 或 C-Kit 基 因 突 变 （W ／ WV） 小 鼠 的 曲 细 精 管 和 睾 丸 间 隙 中 ，移 植 10 ～ 12 周 后 ，研 究 者 发 现 移 植 的 骨 髓 细胞在受体睾丸组织中存活， 一些标记 有 GFP 阳 性 的 供 体 细 胞 在 曲 细 精 管 中 表 现出支持细胞特性并表达促卵泡刺激素 受体。 在白消安处理的小鼠曲细精管中 GFP 阳 性 的 供 体 细 胞 表 现 出 精 原 细 胞 或 精 母 细 胞 的 特 征 并 表 达 VASA，但 这 些 特 征 并 没 有 出 现 在 W ／ WV 小 鼠 中 ， 因 此 得 出结论，在理想的睾丸环境下，骨髓细胞 可以分化为成体细胞和生殖细胞系，这
Naughton 等 ［15］研 究 发 现 RET 酪 氨 酸 激 酶 ／ GFRA1 复 合 受 体 神 经 胶 质 细 胞 来
实 用 医 学 杂 志 2009 年 第 25 卷 第 14 期

源的神经营养因子信号通路对于调控精 原干细胞的自我更新是十分必要的。 GFRA1 和 RET 的 表 达 在 出 生 后 生 殖 母 细胞亚群中得以鉴定， 而且在正常的精 子发生过程中被精原干细胞严格限定， RET 表 达 的 细 胞 在 精 原 干 细 胞 自 我 更 新 的隐睾模型中大量存在， 作者使用整体 睾 丸 移 植 技 术 来 克 服 小 鼠 由 于 GDNF、 GFRA1、RET 缺 失 所 致 的 生 后 致 死 率 的 限制。在出生后 7 d 精子发生的第一轮过 程 中 ， 每 个 突 变 的 睾 丸 显 示 严 重 的 SSC 缺 乏 ， 这 些 缺 陷 是 由 于 SSC 不 能 有 效 增 殖和维持未分化状态的结果。 研究中作 者 证 实 了 RET 酪 氨 酸 激 酶 和 GFRA 复 合 受体定居在生殖细胞。 有意思的是，它们 暂时的表达可以在与干细胞功能相关的 蛋白质中观察到 。 ［16－17］ 这说明表达 RET 的 生 殖 细 胞 有 可 能 代 表 着 SSCs，且 RET 信 号 传 导 对 于 精 子 发 生 过 程 中 SSC 功 能 起 到重要的调节作用。
2004 年 Clark 等 ［5］ 首 次 利 用 胚 体 提 供微环境进行了人胚胎干细胞向生殖细 胞的体外诱导分化试验。 比较了三个多 潜能人胚胎干细胞系于来自内细胞团细 胞的转录特征， 发现内细胞团细胞表达 NANOS1、Stella 及 OCT4。 而 未 分 化 的 人 胚胎干细胞除表达这些基因外， 还表达 生 殖 细 胞 特 异 性 基 因 DAZL。