蛋白质浓度的紫外测定
紫外分光法测定蛋白质含量实验流程
紫外分光法测定蛋白质含量实验流程英文回答：Ultraviolet Spectrophotometry for Protein Quantification.Principle:Ultraviolet spectrophotometry is a widely used technique for protein quantification. It is based on the principle that proteins absorb ultraviolet (UV) light at a wavelength of 280 nm, primarily due to the presence of aromatic amino acids (tyrosine and tryptophan) in their structure. By measuring the absorbance of a proteinsolution at 280 nm, the concentration of the protein can be determined.Materials:UV-Vis spectrophotometer.Quartz cuvettes.Protein sample.UV-transparent buffer (e.g., phosphate-buffered saline)。
Procedure:1. Prepare the sample: Dilute the protein sample in the UV-transparent buffer to an appropriate concentration range (typically 0.1-1 mg/mL).2. Zero the spectrophotometer: Fill a quartz cuvette with the UV-transparent buffer and place it in the spectrophotometer. Set the wavelength to 280 nm and adjust the instrument to zero absorbance.3. Measure the absorbance of the sample: Replace the buffer cuvette with a cuvette containing the protein sample and measure the absorbance at 280 nm.4. Calculate the protein concentration: The protein concentration can be calculated using the Beer-Lambert Law:Concentration (mg/mL) = (Absorbance Dilution Factor) / (Extinction Coefficient)。
[指南]蛋白质浓度的测定方法总结
![[指南]蛋白质浓度的测定方法总结](https://img.taocdn.com/s3/m/9b0f826e30b765ce0508763231126edb6f1a7664.png)
一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。
选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。
从而显得结果很不稳定。
蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。
紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量0【实验目的】01. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
02. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
0【实验原理】0大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
0紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
0【实验材料】01.实验器材0试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。
02.实验试剂0(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。
0(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
0【实验操作】01. 绘制标准曲线0取7支试管按下列各表加入各试剂：0二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。
实验6紫外测定蛋白质的浓度吸收法
实验6 紫外测定蛋白质的浓度吸收法一、目的1、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。
2、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。
二、原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。
此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。
但可作为初步定量的依据。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、标准蛋白溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/mL的溶液。
2、待测蛋白溶液配制成浓度约为1mg/mL的溶液。
（二）器具1、紫外分光光度计。
2、试管和试管架。
3、吸量管。
四、操作步骤（一）标准曲线法1、标准曲线的绘制按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。
选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm 波长处分别测定各管溶液的A280值。
以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定取待测蛋白质溶液1mL ，加入蒸馏水3mL ，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
（二）其他方法（1）将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm 处分别测出A 值，然后利用280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。
计算蛋白质浓度（mg/mL ）=1.45A 280-0.74A 260式中A 280和A 260 分别是蛋白质溶液在280nm 和260nm 波长下测得的光吸收值。
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
药典-蛋白质含量测定(紫外吸收法、Lowrry法、双缩脲法)
3.1.1 蛋白质含量第一法紫外吸收法（见EPO）用4g/L的碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。
以4g/L的碳酸氢铵溶液作为可被，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm 和350nm的吸光度。
用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。
紫外-可见分光光度法，在波长276~280nm处，测定供试品的溶液最大吸光度A max，将A max对应波长代入回归方程，求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散色。
计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。
蛋白质含量(mg/ml)=(A max -A光散色)/ 7.43 x 供试品稀释倍数x 10。
1.仪器的校正和鉴定1)波长允许误差：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm2)吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。
3)杂散光碘化钠、亚硝酸钠2.测定法，1)对照品比较法(c x)= (A x/A R) c R，其中c x为供试品浓度；A x 为供试品溶液的吸光度c R为对照品浓度；A R为对照品溶液的吸光度。
2)吸收系数法通常吸收系数大于1003)计算分光光度法4)比色法第二法Lowry法本法用于微量蛋白质的含量測定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂1〉酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10小时。
取下回流管，加入硫酸锂150g 、水50ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴，冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。
紫外吸收光谱测蛋白
紫外吸收光谱测蛋白
紫外吸收光谱是一种常用的方法来测定蛋白质的含量和结构。
蛋白质在紫外区域（200-400纳米）会吸收特定波长的紫外光，这个吸收峰可以用来确定蛋白质的含量和一些结构信息。
测定蛋白质含量可以使用280纳米处的吸收峰。
蛋白质中存在芳香性氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸），它们对紫外光的吸收非常敏感。
蛋白质溶液在280纳米处的吸光度与蛋白质的浓度成正比关系，可以通过比较未知蛋白质样品的吸光度与已知浓度的标准样品的吸光度来计算蛋白质的含量。
另外，紫外吸收光谱还可以提供蛋白质的一些结构信息。
例如，蛋白质中的α-螺旋结构在208和222纳米处会有明显的吸收峰。
通过检测这些吸收峰的强度和位置变化，可以了解蛋白质的次级结构变化，例如螺旋含量的变化。
需要注意的是，紫外吸收光谱只能提供一些关于蛋白质结构的粗略信息，对于具体的三维结构和功能的研究还需要使用其他更加精细的技术，如X射线晶体学和核磁共振等。
同时，在进行蛋白质测定时，还需要考虑到可能存在的干扰物，如其他溶液成分或污染物对吸收峰的影响，需要进行适当的校正和纯化处理。
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
蛋白质的定量测定(一)─紫外吸收测定法
实验名称：蛋白质的定量测定（一)─紫外吸收测定法【实验原理】蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基，使蛋白质在280nm处有最大吸收峰。
在一定浓度范围内，蛋白质溶液280nm吸光度与蛋白质浓度成正比，可以用这一性质用作蛋白质定量测定。
【实验准备】一、材料（1）血清（2）待测蛋白质溶液二、试剂（1）标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，再根据其纯度用0.9%NaCl配制成浓度为1.0mg/ml蛋白质溶液。
（2）0.9%NaCl溶液（3）饱和（NH4）2SO4溶液三、器材（1）紫外分光光度计（2）试管和试管架（3）吸量管（4）离心机（5）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取8支试管，编号，按下表加入试剂。
测定各管溶液的吸光度值（A280）。
以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。
二、样品测定（1）待测蛋白质溶液含量测定：取待测蛋白质溶液1ml置于10ml试管中，加入3ml0.9%NaCl 溶液，混匀。
以0.9%NaCl溶液为空白溶液，用紫外分光光度计测出待测蛋白质溶液280nm 的吸光度值（A280）。
（2）血清球蛋白含量测定：取新鲜血清100μｌ，边播边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液100μｌ，混匀后室温放置10min，3000rpm离心10min，弃去含清蛋白的上清液，于淀中加入0.9%NaCl 溶液0.5ml，振摇使其溶解，即为粗提球蛋白溶液，再加0.9%NaCl溶液7.5ml，混匀，以0.9%NaCl溶液为空白溶液，测出血清球蛋白溶液280nm的吸光值（A280）。
【实验结果】（1）测出数据如下图所示（2）以标准蛋白质浓度为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线。
（3）根据测得的待测蛋白质溶液的吸光度值（A280），在已绘制好的标准曲线图中查出蛋白质含量，再乘以稀释倍数，即为待测蛋白质溶液的蛋白质含量。
0.27×4=1.08mg•ml-1（3）根据血清球蛋白溶液的吸光度值（A280），在绘制好的标准曲线图中查出蛋白质含量，并乘以稀释倍数，即为血清球蛋白溶液的蛋白质含量。
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蛋白质浓度的紫外测定
1 实验目的
（1）了解蛋白中20个常见氨基酸的结构
（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质的原理及应用
2 实验原理
蛋白质分子中所含酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的芳香环结构对紫外光有吸收作用。
色氨酸的吸收最强，但由于一般蛋白质中酪氨酸的含量比色氨酸高许多，因此这一吸收可认为主要是由酪氨酸提供的。
其最大值在280nm附近，不同的蛋白质吸收波长略有差别。
在无其他干扰物质存在的条件下，280nm的吸光度即可作蛋白质的测定用，但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异。
1 mg/ml浓度的不同蛋白质的吸光度值在
0.5~2.5之间，因此测定未知浓度蛋白需用同种蛋白质对照结果才可靠。
测量方法和计算公式：
a) 对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm波长处的光吸收值，蛋白浓度与吸光度值成正比关系。
b) 对于存在核酸污染（A280/A260<0.6）蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm和260 nm波长处的光吸收值，或280 nm和205 nm波长处光吸收值，按照以下经验公式计算：
蛋白浓度（mg/ml）= （1.55 ×A280）－（0.76 ×A260）（1）
蛋白浓度（mg/ml）= A205÷(27 ＋A280/A205) （2）将280nm的吸光度与260nm的吸光度各乘以系数相减求得接近的蛋白质浓度。
A280与A260分别代表光径为1cm时样品在280nm和260nm的吸光度值。
本实验中使用的牛血清白蛋白样品纯度高，可忽略核酸等其他生物样品对紫外吸收的影响，可直接做吸光度值与蛋白浓度的标准工作曲线。
紫外线吸收适用于蛋白质浓度为0.2~0.5mg/ml 的样品的测定。
由于玻璃器皿会吸收紫外线，实验中需用石英池做容器。
3 仪器和试剂
（1）仪器
石英比色池一个，移液器（配枪头），紫外/可见分光光度计V arian 50 Probe
UV-Visible Spectrophotometer
（2）药品
牛血清白蛋白（biotech Grade）溶液以0.9%NaCl 作溶剂配制，浓度为1mg/ml，0.9% NaCl溶液。
4 实验步骤
（1）在一组干的样品管中，将1mg/mL浓度的牛血清白蛋白用0.9%NaCl分别稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
体积均为4mL。
（2）用紫外可见分光光度计分别测定每一浓度的白蛋白溶液的A280值，以0.9%NaCl作为空白调基线，记录所得读数，做标准工作曲线，并检查计算所得结果是否与实际浓度相符。
（3）取未知浓度待测蛋白溶液，测定A280值，根据标准工作曲线计算待测液浓度。
5 实验数据记录及处理
（1）根据实验记录的数据做出各浓度样品的吸收曲线如下：
图一各浓度样品的吸收曲线
（2）标准工作曲线
根据记录的数据，发现各个吸收都是在波长277.94772nm 处有最大吸光度，记录各浓度溶液该处吸光度，做出标准工作曲线如图2
：
图2 标准工作曲线（左）及其线性拟合数据（右）
（3）待测溶液浓度测定
根据待测溶液吸光度读取数据A 277=0.15931，代入图2的拟合关系中，可以得到待测液
的浓度：
c=0.25 mg/mL
6 结果分析
从标准工作曲线的拟合度来看，达到了0.9993说明实际浓度与所得结果较为符合，实验较为准确。
实验中还需要注意以下事项：
（1）空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。
如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。
（2）测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm 的石英吸收池。
（3）在规定的吸收峰波长±2nm 以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm 以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波长作为测定波长。
（4）由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。
Linear Regression for DA TA1_B: Y = A + B * X
Parameter V alue Error --------------------------------------- A -0.01131 0.00153 B 0.66954 0.00462
--------------------------------------- R SD N P
---------------------------------------- 0.99993 0.00146 5 <0.0001
7实验讨论
（1）紫外吸收法测定蛋白质浓度有何优缺点？受哪些因素影响和限制？
答：
优点缺点限制因素
灵敏度高
廉价
测定快速便捷测定干扰物质少易产生干扰（如核酸）
测定浓度不能过大
标准曲线仍有偏差
对蛋白质纯度要求较高
温度
浓度
酸碱性
人为操作因素
（2）紫外吸收法还可以用来做蛋白质哪些方面的研究？
答：在质量监督方面可以用来检测肉类中蛋白质含量是否达标，文献信息如下：文献名称紫外吸收光谱法测定猪肉中蛋白质的含量
作者张墨英; 程瑞庆;
摘要用紫外吸收光谱测定法测定了猪肉中蛋白质的含量，与凯氏定氨法对照，二者无显著性差异，前者准确度较高，重现性好，简单方便。