原核基因表达及其调控
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原核生物中的基因表达调控机制研究
原核生物中的基因表达调控机制研究原核生物是一类简单的微生物，其基因组通常比真核生物要小很多。
然而，尽管其基因组规模远远小于真核生物，原核生物也拥有多种复杂而精密的基因表达调控机制来满足其生存需要。
基因表达调控机制是指在细胞内对DNA的转录和翻译过程进行调节以产生所需要的蛋白质的过程。
在原核生物中，这些机制通常包括三个主要组成部分：传感器、转录因子和mRNA降解。
传感器细菌细胞的传感器是一类直接感知化学和物理变化的蛋白质。
这些蛋白质用于检测环境中的外部刺激，并转化成细胞内部的信号，从而控制细胞中各种基因的表达。
例如，细菌常见的一种细胞外信号分子是叫做靶向短肽的核苷酸（Quorum sensing），这种信号分子可以诱导细菌在其群落中一起合作，发生种种复杂的行为，并在人类的疾病中扮演重要角色。
转录因子转录因子主要控制DNA的转录。
这些蛋白质最早是作为一类拟合法因子，即可以结合在DNA上而不影响其双链结构的物质而被发现的。
现在，我们知道转录因子可以主导转录过程，根据它们的不同类型，可以启动（激活基因）、抑制（抑制基因）基因转录和发生微调等。
细菌细胞往往通过转录因子对基因转录进行快速、有选择性的调节，以应对不同的环境刺激。
例如，环境中特定的营养成分缺乏时，细菌会使用转录因子来控制PMF或pH梯度、调节某些基因或启动新的代谢通路。
mRNA降解mRNA降解是另外一个调控基因表达的机制。
在原核生物中，mRNA降解是通过一个复杂的蛋白质网络对它进行分解的。
这种分解方式保证了细菌细胞可以在短时间内适应新的环境，以更好地执行工作任务。
例如，在感染宿主的过程中，一些细菌会分泌出一种通过mRNA降解来进行快速调节的蛋白质。
综上所述，原核生物中的基因表达调控机制是十分复杂而又精密的，它们与细菌细胞的应答和适应机制密不可分。
这些机制的绝大多数已经通过大量的研究得到了认识，并且得到了高度的精确度和准确度的分析。
尽管如此，道路依然漫长，原核生物中的基因表达调控机制仍有很多方面需要进一步探索，为我们更深入地了解这些古老而神秘的生命之源提供了良好的平台。
分子生物学第七章原核生物基因表达调控
基因表达调控对于生物体的正常生长、发育、代谢和应激反应等 过程至关重要，是生物体适应环境变化和维持内环境稳态的重要 机制。
原核生物基因表达调控的特点
01
原核生物基因表达调控通常由特 定的转录因子、RNA聚合酶以及 其他调控蛋白介导，通过与DNA 的结合或解离来调节基因转录。
02
原核生物基因表达调控具有快速 响应环境变化的特点，能够在短 时间内调整基因表达模式，以适 应外界刺激和压力。
翻译后加工的调控
翻译后加工的调控
在翻译后加工阶段，新合成的蛋白质经过一系列修饰和加工，最终成为具有生物学活性的蛋白质。原 核生物通过控制翻译后加工酶的合成和活性来调控翻译后加工过程。此外，原核生物还可以通过控制 蛋白质的稳定性来影响其功能和表达水平。
总结
翻译后加工是基因表达调控的重要环节，原核生物通过控制翻译后加工酶的合成和活性，以及蛋白质 的稳定性来精细调控基因表达。
翻译延伸的调控
翻译延伸的调控
在翻译延伸阶段，核糖体沿着mRNA移动，将氨基酸组装成蛋白质。原核生物通过控制翻译延伸因子的合成和活 性，以及核糖体的合成和组装来调控翻译延伸。此外，原核生物还可以通过控制mRNA的结构和稳定性来影响翻 译延伸。
总结
翻译延伸是基因表达调控的重要环节，原核生物通过控制翻译延伸因子的合成和活性，以及核糖体的合成和组装， 以及mRNA的结构和稳定性来精细调控基因表达。
翻译起始的调控
原核生物通过控制翻译起始来调控基因表达。在翻译起始阶段， mRNA与核糖体结合，招募翻译所需的起始因子和其他成分。原 核生物通过控制起始因子的合成和活性，以及mRNA与核糖体的 结合来调控翻译起始。
总结
翻译起始是基因表达调控的重要环节，原核生物通过控制翻译起 始因子的合成和活性，以及mRNA与核糖体的结合来精细调控基 因表达。
原核生物基因表达调控的特点
01
原核生物基因表达调控通常由特 定的转录因子、RNA聚合酶以及 其他调控蛋白介导，通过与DNA 的结合或解离来调节基因转录。
02
原核生物基因表达调控具有快速 响应环境变化的特点，能够在短 时间内调整基因表达模式，以适 应外界刺激和压力。
翻译后加工的调控
翻译后加工的调控
在翻译后加工阶段，新合成的蛋白质经过一系列修饰和加工，最终成为具有生物学活性的蛋白质。原 核生物通过控制翻译后加工酶的合成和活性来调控翻译后加工过程。此外，原核生物还可以通过控制 蛋白质的稳定性来影响其功能和表达水平。
总结
翻译后加工是基因表达调控的重要环节，原核生物通过控制翻译后加工酶的合成和活性，以及蛋白质 的稳定性来精细调控基因表达。
翻译延伸的调控
翻译延伸的调控
在翻译延伸阶段，核糖体沿着mRNA移动，将氨基酸组装成蛋白质。原核生物通过控制翻译延伸因子的合成和活 性，以及核糖体的合成和组装来调控翻译延伸。此外，原核生物还可以通过控制mRNA的结构和稳定性来影响翻 译延伸。
总结
翻译延伸是基因表达调控的重要环节，原核生物通过控制翻译延伸因子的合成和活性，以及核糖体的合成和组装， 以及mRNA的结构和稳定性来精细调控基因表达。
翻译起始的调控
原核生物通过控制翻译起始来调控基因表达。在翻译起始阶段， mRNA与核糖体结合，招募翻译所需的起始因子和其他成分。原 核生物通过控制起始因子的合成和活性，以及mRNA与核糖体的 结合来调控翻译起始。
总结
翻译起始是基因表达调控的重要环节，原核生物通过控制翻译起 始因子的合成和活性，以及mRNA与核糖体的结合来精细调控基 因表达。
第六章 原核基因表达调控
第六章 原核基因表达调控模式
-- 乳糖(+)时, 葡萄糖（+）
二.乳糖操纵子调节机制
i基因
有诱导物时
P
O
Lac Z
Lac Y 转录
lac A
阻遏蛋白 阻遏物 蛋白亚基 无活性的 阻遏蛋白
翻译 转录水平低, 没有乳糖酶的合成 β- 半乳糖苷酶 β- 半乳糖苷通透酶 β- 半乳糖苷乙酰转移酶
mRNA
诱导物
第六章 原核基因表达调控模式
一.
概述
根据细菌酶的合成对环境的反应不同，分为:
组成酶 细菌酶 诱导酶
适Байду номын сангаас酶
阻遏酶
第六章 原核基因表达调控模式
3. 原核基因表达的多级调控
四个基本调控点: 基因活化 转录水平上的调控
最有效的调节环节
一.
概述
转录起始--- DNA元件与调控蛋白相互作用调控 mRNA加工成熟水平的调控 转录后水平上的调控 翻译及翻译后水平的调控
调节基因的产物-阻遏蛋白
负控诱导 负控阻遏 正控诱导
调控机制
负转录调控 (为主) 正转录调控
正控阻遏
调节基因的产物-激活蛋白
第六章 原核基因表达调控模式
负调控 Lac O 正调控 Ara O
一.
概述
诱
导 阻遏物 阻遏 诱导物 诱导
失活的阻遏物 失活的活性蛋白 阻遏
活化的激活蛋白 诱导物 诱导
Trp O
（1） 葡萄糖(+), 乳糖(–)时,
- 乳糖(–)时, 无别乳糖存在，阻遏蛋白与操纵子上的 O序列结合, 使操纵子处于关闭状态，三个结构基因 不表达。 - 葡萄糖(+)及cAMP浓度低时，CAP 活性低, 无 cAMP- CAP复合物形成。
3原核生物基因表达与调控
由20个氨基酸残基的小肽组成, 其中羧基端的α螺 旋为识别螺旋(由7~9个氨基酸组成), 负责识别DNA大 沟的特异碱基序列；
另一个螺旋(由7~9个氨基酸组成),没有碱基特异性, 与DNA磷酸戊糖链骨架接触。在与DNA特异结合时, 靠蛋白质的氨基酸侧链与特异碱基对之间形成氢键、 疏水键和发生静电相互作用 。
二、lac操纵子的分解代谢产物阻遏
β-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把前者 分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖 同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄 糖之前不会诱发lac操纵子，这种现象称为葡萄 糖效应（glucose effect）。
原因：是葡萄糖的某些降解产物抑制了lac
mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应 称之为分解代谢产物阻遏效应（catabolite repression）。
基因表达调控(gene regulation or gene
control):任何影响基因转录过程和翻译过程 的开启、关闭和这两个过程速率的较为直接 的因素及其作用。
第一节 细菌的转录调控
一、细菌操纵子
操纵子学说———关于原核生物基因结构及其表达 调控的学说。
操纵子（operon）: 细菌基因表达和调控的单位， 包括共转录到一条mRNA上的多个结构基因和这些基 因转录所需的顺式作用元件，这些元件包括启动子、 操作子和转录调控有关的序列。
能从合成地点扩散到其它场所对其他基因的表达起 调控作用的蛋白质因子（有时为RNA）。起作用的过 程称反式作用。
二、阻遏物和激活物
阻遏物（repressor）: 阻止基因表达的蛋白质，可与操 作子结合来阻止转录，为负调控蛋白。
激活物（activator）:促进基因转录的蛋白质 ，为正调控 蛋白。
另一个螺旋(由7~9个氨基酸组成),没有碱基特异性, 与DNA磷酸戊糖链骨架接触。在与DNA特异结合时, 靠蛋白质的氨基酸侧链与特异碱基对之间形成氢键、 疏水键和发生静电相互作用 。
二、lac操纵子的分解代谢产物阻遏
β-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把前者 分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖 同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄 糖之前不会诱发lac操纵子，这种现象称为葡萄 糖效应（glucose effect）。
原因：是葡萄糖的某些降解产物抑制了lac
mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应 称之为分解代谢产物阻遏效应（catabolite repression）。
基因表达调控(gene regulation or gene
control):任何影响基因转录过程和翻译过程 的开启、关闭和这两个过程速率的较为直接 的因素及其作用。
第一节 细菌的转录调控
一、细菌操纵子
操纵子学说———关于原核生物基因结构及其表达 调控的学说。
操纵子（operon）: 细菌基因表达和调控的单位， 包括共转录到一条mRNA上的多个结构基因和这些基 因转录所需的顺式作用元件，这些元件包括启动子、 操作子和转录调控有关的序列。
能从合成地点扩散到其它场所对其他基因的表达起 调控作用的蛋白质因子（有时为RNA）。起作用的过 程称反式作用。
二、阻遏物和激活物
阻遏物（repressor）: 阻止基因表达的蛋白质，可与操 作子结合来阻止转录，为负调控蛋白。
激活物（activator）:促进基因转录的蛋白质 ，为正调控 蛋白。
第14章 原核生物基因表达调控
第14章原核生物基因的表达调控重点：操纵子的结构特点和功能；乳糖操纵子的正负调控；色氨酸操纵子的衰减作用。
难点：色氨酸操纵子的衰减作用。
第一节基因调控的基本定律一、基因调控水平二、基因和调控元件三、DNA结合蛋白一、基因调控水平基因表达的调控可以发生在DNA到蛋白质的任意节点上，如基因结构、转录、mRNA 加工、RNA的稳定性、翻译和翻译后修饰。
二、基因和调控元件基因：是指能转录成RNA的DNA序列。
结构基因：编码代谢、生物合成和细胞结构的蛋白质。
调节基因：产物是RNA或蛋白质，控制结构基因的表达。
其产物通常是DNA结合蛋白。
调控元件：不能转录但是能够调控基因表达的DNA序列。
三、DNA结合蛋白调控蛋白通常含有与DNA结合的结构域，一般由60-90个氨基酸组成。
在一个结构域中，只有少数氨基酸与DNA接触。
这些氨基酸（包括天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和精氨酸）常与碱基形成氢键，或者与磷酸核糖骨架结合。
根据DNA结合结构域内的模体，可以将DNA结合分成几种类型（图16.2）。
第二节大肠杆菌的乳糖操纵子一、操纵子结构二、正负调控三、乳糖操纵子四、lac突变五、正控制一、操纵子结构原核和真核生物基因调控的主要差异在于功能相关的基因的组成。
细菌的功能相关的基因常常排列在一起，并且由同一启动子控制。
一群一起转录的细菌的结构基因（包括其启动子和控制转录的额外序列）称为操纵子。
二、正负调控转录水平上的调控主要有两种类型：负调控：gene ON 阻遏蛋白 OFF正调控：gene OFF 激活蛋白 ON诱导：活性阻遏蛋白 失活诱导因子＋非活性激活蛋白 活性阻遏：失活阻遏蛋白 活性共阻遏蛋白＋活性激活蛋白 失活三、乳糖操纵子乳糖操纵子是诱导型操纵子，当诱导物不存在时，阻遏蛋白结合到操纵序列上并阻止转录；当诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物结合后失去活性，转录才得以进行。
四、lac突变为了鉴定乳糖操纵子各个成分的功能，Jacob和Monod做了细菌的接合实验，其中供体菌的F’因子上也带有乳糖操纵子。
原核生物基因表达调控
Repressor
cAMP
CAP
葡萄糖不存在，乳糖存在，阻遏蛋白失活，cAMP+CAP与CAP位点结合结合，促进基因转录
The Lac Operon: III. 葡萄糖和乳糖都存在
Repressor
RNA Pol.
CAP Bindin
g
Promoter
Operator X
LacZ
Repressor负调节与正调节协调合作
• 阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用 • 如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从操作基因上解聚仍无转录活性
3）正调控和负调控
正调控(positive control)
在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入某种调节蛋白后基因活性就被开启，这样的调控为正转录 调控。
调节基因
操纵基因
结构基因
调节蛋白
mRNA 酶蛋白
负调控（negative control)
在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调 控负转录调控。
2）结构基因和调节基因
➢ 组成基因/管家基因（constitutive gene, housekeeping gene）是指不大受环境变动而持 续表达的一类基因。如ＤＮＡ聚合酶，ＲＮＡ聚合酶等代谢过程中十分必需的酶或蛋白质的基因 。 ➢调节基因（regulated gene）指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因。如：不同生 长发育时期表达的一些基因。
• 别乳糖是lac操纵子转录的活性诱导物 • 异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside：IPTG）结构上类似于别乳糖，是乳糖操纵
子非常有效的诱导物。可诱导lac操纵子表达，但不能被β-半乳糖苷酶水解。 • 这种能诱导酶合成，但不能被酶分解的分子称为安慰诱导物（gratuitous inducer）。安慰诱导
原核生物基因表达的调控
操纵子学说的基本内容
1961年，法国科学家莫诺（J·L·Monod，1910-1976）与雅可布 （F·Jacob）发表“蛋白质合成中的遗传调节机制”一文，提出操纵子学 说，开创了基因调控的研究。四年后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝 尔生理学与医学奖。
莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的 自动控制系统，这个自动控制系统负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。 乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生一种酶（叫做“半乳糖 苷酶”），能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，以便作进一步的代谢利 用。编码半乳糖苷酶的基因（简称z）是一个结构基因（structural gene）。这个结构基因与操纵基因共同组成操纵子。操纵基因受一种叫作 阻遏蛋白的蛋白质的调控。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起 诱导作用，它与阻遏蛋白结合，使之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵 基因开启，相邻的结构基因也表现活性，细菌就能分解并利用乳糖了，这 样，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。
原核生物基因表达的调控
基因调控
生物体内的每个细胞都有全套的基因，但细胞中的基因并不是同 时表达的。因细胞的类型和执行的功能不同，细胞中有的基因开 启，有的基因关闭，如血红蛋白基因只在红细胞中表达，消化酶 只在消化腺细胞中表达。这其中存在着复杂的基因调控。 某些基因不断地进行转录和翻译，产生出各种蛋白质，通常称之 为基因表达。每个细胞都有一套完整的基因调控系统，使各种蛋 白质只有在需要时才被合成，这样就能使生物适应多变的环境， 防止生命活动中的浪费现象和有害后果的发生，保持体内代谢过 程的正常状态。但是，原核细胞和真核细胞的基因调控有着明显 的区别。 原核细胞表达的基因调控，比真核细胞要相对简单，这里以大肠 杆菌乳糖操纵子为例来说明。
分子生物学 第十一章 原核基因表达的调控
二聚体， 45KD， 由crp编码
被cAMP激活 结合位点～22bp I -70 ~ -50
II -50 ~ -40
结合位点序列保守 不同基因受cAMP激活的水平不同
3 CAP的结合对DNA构型的影响
DNA弯曲 弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心 弯曲使CAP能与启动子上的RNA pol 接触
Summary
CA
B A: RNA polymerase B: lac repressor C: CRP-cAMP
Summary of lac operon regulation
Glucose High High Low Low
cAMP Low Low High High
Lactose Absent Present Absent Present
• 加入CAP，转录
• lac UV-5突变， -10区 TATGTT → TATAAT 在无CAP时，转录
• DNA topI 突变，降低起始转录对CAP的依赖
cAMP-CAP复合物的结合，使位点II附近的富含GC 区域双螺旋结构稳定性降低，因而-10区的熔解温度降 低，促进开放型启动子复合物的形成
9 原核生物基因表达的调控
9.1 基因表达概述 9.2 操纵元控制理论 9.3 基因转录的时序调控 9.4 转录后加工的调控 9.5 翻译水平的调控
孙朱乃玉恩贤
9.1 基因表达概述
9.1.1 生物遗传信息
9.1.1.1 C值矛盾 C value paradox
Genome DNA
10%; 结构基因的编码序列
triplet codon 90%; 重复，间隔，调节序列…
基因选择性表达指令 重要的遗传信息
.9.1.1.2 遗传信息的两大类别
被cAMP激活 结合位点～22bp I -70 ~ -50
II -50 ~ -40
结合位点序列保守 不同基因受cAMP激活的水平不同
3 CAP的结合对DNA构型的影响
DNA弯曲 弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心 弯曲使CAP能与启动子上的RNA pol 接触
Summary
CA
B A: RNA polymerase B: lac repressor C: CRP-cAMP
Summary of lac operon regulation
Glucose High High Low Low
cAMP Low Low High High
Lactose Absent Present Absent Present
• 加入CAP，转录
• lac UV-5突变， -10区 TATGTT → TATAAT 在无CAP时，转录
• DNA topI 突变，降低起始转录对CAP的依赖
cAMP-CAP复合物的结合，使位点II附近的富含GC 区域双螺旋结构稳定性降低，因而-10区的熔解温度降 低，促进开放型启动子复合物的形成
9 原核生物基因表达的调控
9.1 基因表达概述 9.2 操纵元控制理论 9.3 基因转录的时序调控 9.4 转录后加工的调控 9.5 翻译水平的调控
孙朱乃玉恩贤
9.1 基因表达概述
9.1.1 生物遗传信息
9.1.1.1 C值矛盾 C value paradox
Genome DNA
10%; 结构基因的编码序列
triplet codon 90%; 重复，间隔，调节序列…
基因选择性表达指令 重要的遗传信息
.9.1.1.2 遗传信息的两大类别
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
pOP203-1,2,3、pOP203-13、pOP203-24、 pOP203-27、pOP203-28、pOP203-29
2、含trp 启动子的表达载体：
（1）产生的表达蛋白的量高于lac启动子；
（2）所有含trp启动子的表达载体都受到3--吲哚丙烯 酸（IAA）的诱导。
如：pDR720
质粒载体pDR720结构示意图
特点：
1）Ampr； 2）tac启动子； 3）lacZ核糖体结合部位；
4）ATG起始密码子，位于
RBS下游8bp处； 5）来源于-噬菌体的终止 子T1和T2，以避免其它 基因的过度转录。
4、含PL 启动子的表达载体：
是一种极强的启动子，所以被广泛用于各种载体的 构建； 如：pPL-; （1）来源于pBR322, pBR322的EcoRI/BamHI位点 被PL 和N基因取代； （2）外源基因可以插入到N基因中的HpaI位点； （3）当培养温度为29-31C时，PL启动子处于阻遏 状态；但当温度升到42C，发生脱阻遏。
质粒载体pPL-结构示意图
（三）提高蛋白质的表达量
某些表达载体被构建用于增加蛋白质的表达量，例如，
pPLc2833 :
（1）强启动子；
（2）选择性标记； （3）多克隆位点（MCS）
Байду номын сангаас
其衍生质粒pCP3的构建：将pPLc2833的复制起始位点替 换为另一个质粒pKN402。 质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42C时仍然 有很强的复制起始的功能。
Glucose reduces CRP activiy
CRP复合物形成促进 RNA聚合酶与启动 子的结合
当CAP与cAMP协同作用时，其对启动子的亲和性发生增强，而此时如果葡 萄糖的量达到最低时，其亲和性最高。这样，当诱导物存在时，高浓度 的cAMP水平能够导致乳糖操纵子的启动子发生高水平的转录作用。
（ONTG）后可发生脱阻遏作用。
乳糖操纵子基因产物:
1) lacI: 阻遏蛋白; 2) lacZ：-半乳糖苷酶； 3) lacY：透性酶; 4) lacA：硫代半乳糖苷转乙酰基酶
cAMP参与乳糖操纵子的调控：
（1）cAMP通过与cAMP受体蛋白（CRP）结合，引起CRP构
象变化，形成一种有活性的cAMP-CRP复合物；
游加入了-半乳糖苷酶的
编码序列（ -gal）21 bp 片断和一个EcoRI位点； （2）其融合蛋白的N端为-半乳 糖苷酶的前7个氨基酸和 EcoRI接头编码的少数几个 氨基酸，其C端为完整的外 源蛋白。
表达载体pOP203质粒结构示意图
pOP203系列表达载体：A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter
遏作用，PL启动子开始启动转录过程。
PL 启动子
噬菌体左向操纵子结构示意图 PL为噬菌体左向早期启动子，控制基因从N到att的早期转录，受 到cI所编码的阻遏蛋白的调控。
优良表达载体的性能
（1）强转录启动子和终止子； （2）核糖体结合位点（RBS）的强弱； （3）质粒载体及其质粒的拷贝数；是否整合到 染色体DNA之上； （4）合成的外源蛋白在细胞中的定位； （5）宿主的翻译效率； （6）克隆载体所表达的外源蛋白的稳定性。
（2）很多目的基因能在E. coli中迅速而有效地表达；
（3）其培养条件易于掌控，培养费用相对较低。。
非调控启动子：对细胞产生伤害
(1) 持续性地高水平表达某一目的基因会过分消耗
宿 主细胞的营养和能源，最终造成致死效应; (2) 由于使宿主细胞处于生长的逆境，容易发生载 体
质粒的丢失；
(3) 非调控性地表达外源蛋白，容易受到蛋白酶的
由启动子、衰减子、操纵基因和色氨酸合成的5种酶组成。 （1）由trpR产生的阻遏蛋白只有在与色氨酸结合后才能形成有活 性的阻遏蛋白，它可以与操纵基因结合从而阻止转录的起始。当色 氨酸缺乏时，该阻遏蛋白的前体不能与操纵基因结合，也就不能发 挥阻遏作用，此时转录可起始； （2）当细胞中的色氨酸浓度较高时，在衰减子的作用下，操纵子 DNA形成类似终止子的茎环结构，从而只能翻译出14肽，称为前导
克隆基 达； 因蛋白 2）添加Trp（可添加 合成 蛋白胨）以后，trp启 （脱阻遏） 动子受阻遏，而PL启 动子启动，此时可表 达外源蛋白。
（五）在其它微生物中的表达
除了E. coli以外，有些微生物也可以用作表达外源蛋
白的宿主菌（受体菌）。
-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达：
携带包含大肠杆菌 lacZ 基因和异源启动子的质粒载体的不同革兰氏阴性菌 受体菌中测定的-半乳糖苷酶活性 Promoter -Galactosidase activity (U) in: Escherichia Rhizobium Rhizobium Pseudomonas coli meliloti leguminosarum putida None 16 110 130 150 Nm 1,400 21,800 13,900 16,300 lac 2,000 9,050 6,250 9,800 tac 11,300 2,850 1,150 2,950 S1 40 3,300 1,200 3,350
trp promoter色氨酸启动子 由色氨酸阻遏蛋白进行调控：正调控作用。可 形成启动子-阻遏蛋白复合物。
trp 启动子的脱阻遏可通过： （1）移除色氨酸；
（2）加入色氨酸结构类似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid）. 3’--吲哚丙烯酸
trpR
阻遏蛋白 Trp
色氨酸操纵子（trp operon）
电泳后回收片段c
连接
电泳后回收片段1和3
温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响
由于pKN402和pCP3的复制子在42C时仍然具有很强的起 始复制能力，因此当培养温度升高到42C时，细胞中的
pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高5～10倍。
（四）大规模培养系统
小规模培养（1～5L）含表达载体的重组菌株时，其调控可以直 接向培养基中添加诱导物，或者升高温度，但是在半工业化（20～
lac 启动子
：
（1）lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子，包括启动子、 活化蛋白（catabolite activator protein, CAP）结合位点、操
纵基因和lacZ组成。
（2） lac启动子受到阻遏蛋白（repressor）的负调控，而受到 CAP和cAMP的正调控。其中CAP的正调控是通过增加启动子 与RNA聚合酶的亲和性而起作用。 (3) lac 启动子由于与阻遏蛋白相结合而处于关闭状态，但当 加入乳糖或者半乳糖苷结构类似物，如异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG）、硫甲基半乳糖苷（TMG）和邻硝基苯基半乳糖苷
因置于强启动子PL之下，使其受PL启动子的控制。
A 培养基中不存在色氨酸
cI蛋白合成 （脱阻遏） 无克隆基因蛋白 合成（阻遏） “双载体系统”特点： 1）当培养基中Trp含 量较低时，trp启动子 启动，cI阻遏蛋白合 成，此时PL启动子受 阻遏，目的基因不表
B 培养基中存在色氨酸
cI蛋白不合成 （阻遏）
1、含lac 启动子的表达载体：
多种。其最大的特点是带有编码lacZ（-半乳糖苷酶）的编码序列。 当外源基因插入后，如果能够保持正确的ORF，就可以形成由外源基因编 码的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白。
所有含lac启动子的表达载体都受到IPTG的诱导。
pOP203-13特点
（1）为pBR322衍生质粒，插入 了强启动子PlacUV5并在其下
RNA聚合酶可 形成1个中间 管道
(二)、原核生物基因的翻译
起始因子Initiation factors
(IFs) 可稳定自由状态的 30S 亚基；以及结合起始 tRNA 到 30S-mRNA复合物上
E. coli用作受体菌的优势：
（1）对其遗传学背景、分子生物学、生物化学和生 理学方面的了解较为深入；
大肠杆菌 苜蓿根瘤菌 豌豆根瘤菌 恶臭假单胞菌
-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达分析：
(1) 所有启动子在受体菌中都有一定的活性； (2) tac启动子在大肠杆菌中活性最高，但是在其它 受体菌中活性最低； (3) 新霉素基因启动子（Nm）是在大肠杆菌中活性 最低的启动子，但是在其它受体菌中驱动转录的活性 却最高。
肽。IAA是色氨酸的结构竞争类似物，它可以与阻遏蛋白结合而使
其失去阻遏活性；不能再与操纵基因结合，从而不能阻遏转录过程。
Ptac 启动子：
是来自于lac和trp的一组杂合启动子，但是比lac和trp都强 得多，是一组强启动子。包括： （1） PtacI：PlacUV5的-10区 ＋ Ptrp的-35区； （2） PtacII：Ptrp的-35区（一段合成的包括Pribnow框在
200L）或者工业化大规模（大于200L）生产时，不能采用小规模的
方法：
（1）直接向培养基中添加诱导物如IPTG，由于需要量较大，成本 高，不经济； （2）即使是使用温度敏感的表达载体，升高温度既需要较长的时 间，又需要很大的能源消耗，成本也很高。 一种解决的途径：使用“双质粒系统”：用trp启动子带动编码cI阻遏 蛋白的基因，然后将它们置于一个弱启动子的载体上；将要表达的外源基
内的46bp的DNA） ＋ Plac的操纵基因；
（3） Ptac12：Plac的-10区 ＋Ptrp的-35区 所有Ptac都受IPTG的诱导，同时受到阻遏蛋白的阻遏调控。
PL 启动子：
阻遏蛋白: cI，来源于噬菌体 . cI857 : 为 cI温度敏感突变体. (1) 将携带敏感的cI857 的细菌细胞首先在28 to 30C条件下 培养，此时cI857 阻遏PL启动子的转录； (2) 当细菌细胞被培养至特定浓度时（一般是到达平衡 期），将培养温度升高至42C, 此时cI857 不再发生阻
2、含trp 启动子的表达载体：
（1）产生的表达蛋白的量高于lac启动子；
（2）所有含trp启动子的表达载体都受到3--吲哚丙烯 酸（IAA）的诱导。
如：pDR720
质粒载体pDR720结构示意图
特点：
1）Ampr； 2）tac启动子； 3）lacZ核糖体结合部位；
4）ATG起始密码子，位于
RBS下游8bp处； 5）来源于-噬菌体的终止 子T1和T2，以避免其它 基因的过度转录。
4、含PL 启动子的表达载体：
是一种极强的启动子，所以被广泛用于各种载体的 构建； 如：pPL-; （1）来源于pBR322, pBR322的EcoRI/BamHI位点 被PL 和N基因取代； （2）外源基因可以插入到N基因中的HpaI位点； （3）当培养温度为29-31C时，PL启动子处于阻遏 状态；但当温度升到42C，发生脱阻遏。
质粒载体pPL-结构示意图
（三）提高蛋白质的表达量
某些表达载体被构建用于增加蛋白质的表达量，例如，
pPLc2833 :
（1）强启动子；
（2）选择性标记； （3）多克隆位点（MCS）
Байду номын сангаас
其衍生质粒pCP3的构建：将pPLc2833的复制起始位点替 换为另一个质粒pKN402。 质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42C时仍然 有很强的复制起始的功能。
Glucose reduces CRP activiy
CRP复合物形成促进 RNA聚合酶与启动 子的结合
当CAP与cAMP协同作用时，其对启动子的亲和性发生增强，而此时如果葡 萄糖的量达到最低时，其亲和性最高。这样，当诱导物存在时，高浓度 的cAMP水平能够导致乳糖操纵子的启动子发生高水平的转录作用。
（ONTG）后可发生脱阻遏作用。
乳糖操纵子基因产物:
1) lacI: 阻遏蛋白; 2) lacZ：-半乳糖苷酶； 3) lacY：透性酶; 4) lacA：硫代半乳糖苷转乙酰基酶
cAMP参与乳糖操纵子的调控：
（1）cAMP通过与cAMP受体蛋白（CRP）结合，引起CRP构
象变化，形成一种有活性的cAMP-CRP复合物；
游加入了-半乳糖苷酶的
编码序列（ -gal）21 bp 片断和一个EcoRI位点； （2）其融合蛋白的N端为-半乳 糖苷酶的前7个氨基酸和 EcoRI接头编码的少数几个 氨基酸，其C端为完整的外 源蛋白。
表达载体pOP203质粒结构示意图
pOP203系列表达载体：A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter
遏作用，PL启动子开始启动转录过程。
PL 启动子
噬菌体左向操纵子结构示意图 PL为噬菌体左向早期启动子，控制基因从N到att的早期转录，受 到cI所编码的阻遏蛋白的调控。
优良表达载体的性能
（1）强转录启动子和终止子； （2）核糖体结合位点（RBS）的强弱； （3）质粒载体及其质粒的拷贝数；是否整合到 染色体DNA之上； （4）合成的外源蛋白在细胞中的定位； （5）宿主的翻译效率； （6）克隆载体所表达的外源蛋白的稳定性。
（2）很多目的基因能在E. coli中迅速而有效地表达；
（3）其培养条件易于掌控，培养费用相对较低。。
非调控启动子：对细胞产生伤害
(1) 持续性地高水平表达某一目的基因会过分消耗
宿 主细胞的营养和能源，最终造成致死效应; (2) 由于使宿主细胞处于生长的逆境，容易发生载 体
质粒的丢失；
(3) 非调控性地表达外源蛋白，容易受到蛋白酶的
由启动子、衰减子、操纵基因和色氨酸合成的5种酶组成。 （1）由trpR产生的阻遏蛋白只有在与色氨酸结合后才能形成有活 性的阻遏蛋白，它可以与操纵基因结合从而阻止转录的起始。当色 氨酸缺乏时，该阻遏蛋白的前体不能与操纵基因结合，也就不能发 挥阻遏作用，此时转录可起始； （2）当细胞中的色氨酸浓度较高时，在衰减子的作用下，操纵子 DNA形成类似终止子的茎环结构，从而只能翻译出14肽，称为前导
克隆基 达； 因蛋白 2）添加Trp（可添加 合成 蛋白胨）以后，trp启 （脱阻遏） 动子受阻遏，而PL启 动子启动，此时可表 达外源蛋白。
（五）在其它微生物中的表达
除了E. coli以外，有些微生物也可以用作表达外源蛋
白的宿主菌（受体菌）。
-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达：
携带包含大肠杆菌 lacZ 基因和异源启动子的质粒载体的不同革兰氏阴性菌 受体菌中测定的-半乳糖苷酶活性 Promoter -Galactosidase activity (U) in: Escherichia Rhizobium Rhizobium Pseudomonas coli meliloti leguminosarum putida None 16 110 130 150 Nm 1,400 21,800 13,900 16,300 lac 2,000 9,050 6,250 9,800 tac 11,300 2,850 1,150 2,950 S1 40 3,300 1,200 3,350
trp promoter色氨酸启动子 由色氨酸阻遏蛋白进行调控：正调控作用。可 形成启动子-阻遏蛋白复合物。
trp 启动子的脱阻遏可通过： （1）移除色氨酸；
（2）加入色氨酸结构类似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid）. 3’--吲哚丙烯酸
trpR
阻遏蛋白 Trp
色氨酸操纵子（trp operon）
电泳后回收片段c
连接
电泳后回收片段1和3
温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响
由于pKN402和pCP3的复制子在42C时仍然具有很强的起 始复制能力，因此当培养温度升高到42C时，细胞中的
pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高5～10倍。
（四）大规模培养系统
小规模培养（1～5L）含表达载体的重组菌株时，其调控可以直 接向培养基中添加诱导物，或者升高温度，但是在半工业化（20～
lac 启动子
：
（1）lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子，包括启动子、 活化蛋白（catabolite activator protein, CAP）结合位点、操
纵基因和lacZ组成。
（2） lac启动子受到阻遏蛋白（repressor）的负调控，而受到 CAP和cAMP的正调控。其中CAP的正调控是通过增加启动子 与RNA聚合酶的亲和性而起作用。 (3) lac 启动子由于与阻遏蛋白相结合而处于关闭状态，但当 加入乳糖或者半乳糖苷结构类似物，如异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG）、硫甲基半乳糖苷（TMG）和邻硝基苯基半乳糖苷
因置于强启动子PL之下，使其受PL启动子的控制。
A 培养基中不存在色氨酸
cI蛋白合成 （脱阻遏） 无克隆基因蛋白 合成（阻遏） “双载体系统”特点： 1）当培养基中Trp含 量较低时，trp启动子 启动，cI阻遏蛋白合 成，此时PL启动子受 阻遏，目的基因不表
B 培养基中存在色氨酸
cI蛋白不合成 （阻遏）
1、含lac 启动子的表达载体：
多种。其最大的特点是带有编码lacZ（-半乳糖苷酶）的编码序列。 当外源基因插入后，如果能够保持正确的ORF，就可以形成由外源基因编 码的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白。
所有含lac启动子的表达载体都受到IPTG的诱导。
pOP203-13特点
（1）为pBR322衍生质粒，插入 了强启动子PlacUV5并在其下
RNA聚合酶可 形成1个中间 管道
(二)、原核生物基因的翻译
起始因子Initiation factors
(IFs) 可稳定自由状态的 30S 亚基；以及结合起始 tRNA 到 30S-mRNA复合物上
E. coli用作受体菌的优势：
（1）对其遗传学背景、分子生物学、生物化学和生 理学方面的了解较为深入；
大肠杆菌 苜蓿根瘤菌 豌豆根瘤菌 恶臭假单胞菌
-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达分析：
(1) 所有启动子在受体菌中都有一定的活性； (2) tac启动子在大肠杆菌中活性最高，但是在其它 受体菌中活性最低； (3) 新霉素基因启动子（Nm）是在大肠杆菌中活性 最低的启动子，但是在其它受体菌中驱动转录的活性 却最高。
肽。IAA是色氨酸的结构竞争类似物，它可以与阻遏蛋白结合而使
其失去阻遏活性；不能再与操纵基因结合，从而不能阻遏转录过程。
Ptac 启动子：
是来自于lac和trp的一组杂合启动子，但是比lac和trp都强 得多，是一组强启动子。包括： （1） PtacI：PlacUV5的-10区 ＋ Ptrp的-35区； （2） PtacII：Ptrp的-35区（一段合成的包括Pribnow框在
200L）或者工业化大规模（大于200L）生产时，不能采用小规模的
方法：
（1）直接向培养基中添加诱导物如IPTG，由于需要量较大，成本 高，不经济； （2）即使是使用温度敏感的表达载体，升高温度既需要较长的时 间，又需要很大的能源消耗，成本也很高。 一种解决的途径：使用“双质粒系统”：用trp启动子带动编码cI阻遏 蛋白的基因，然后将它们置于一个弱启动子的载体上；将要表达的外源基
内的46bp的DNA） ＋ Plac的操纵基因；
（3） Ptac12：Plac的-10区 ＋Ptrp的-35区 所有Ptac都受IPTG的诱导，同时受到阻遏蛋白的阻遏调控。
PL 启动子：
阻遏蛋白: cI，来源于噬菌体 . cI857 : 为 cI温度敏感突变体. (1) 将携带敏感的cI857 的细菌细胞首先在28 to 30C条件下 培养，此时cI857 阻遏PL启动子的转录； (2) 当细菌细胞被培养至特定浓度时（一般是到达平衡 期），将培养温度升高至42C, 此时cI857 不再发生阻