Kupffer细胞分离培养
大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究
（ ） 昆明 医学 院第一 附属 医院感 染疾病 科 ，云 南 昆明 １
６０ ３ ； ５ ０ ２
２ 泸州 医学 院附属 医院感 染病 科 ，四川 泸 州 ６ ６ ０ ； ） ４ ０ ０
３ 昆明 医学 院第一 附属 医院生物 治疗 科 ，云 南 昆 明 ６０ ３ ； ） ５０ ２ ４） 中山大 学附属 第三 医院 感染病 科 ，广 东 广 州 ５０ ３ ） １６０
需 进一 步 优 化 ．
［ 关键词 ］肝细胞 ；Ｋ ｐ ｅ 细胞 ；共培养 ｕｆｒ ［ 中图分类号 ］Ｒ ２ ． ８ ［ ３ ９ ２ 文献标识码 ］Ａ ［ 文章编号 ］ １０ ４ ０ （０ ７ ４— ０ ５— ５ ０ ３— ７６ ２０ ）０ ０ ３ ０
Ｃｏ — ｃ ｌｕｒ ｆＨ ｅ ａ ｏ ｙ ｅ ， Ｋ ｕ ｅ ｌ ｏ Ｄ ｔｉ ｔ ｏ ｕ ｔ ｅ ｏ ｐ ｔ ｃ ｔｓ ｆ ｒ Ｃｅ ｌ ｆ Ｓ Ｒａ ｎ Ｖｉｒ
［ ｂ ｔａ ｔ Ａ ｓ ｃ］Ｏｂｅ ｔ ｅ Ｔ ｒｕ ｈＣ —ｃ ｌ ｒ Ｋ ｐ ｅ ｅ ｓｗｔ ｅａｏｙ ｎｖｔ ．ｔ ｕ ｄ ｒｔ ｄｔｅｉ— ｒ ｊｃｉ ｈｏ ｇ Ｏ ｕｔ ｅ ｕ ｆ ｒ ｌ ｉ ｈ ｐ ｔ ｔ ｉ ｉｏ ｏ ｎ ｅｓ ｎ ｎ ｖ ｕ ｃｌ ｈ ｃｅ ｒ ａ ｈ
ｌ ｎ ｅｏ ｆ ｅ ｃ ｆ ｐｆ ｒｃ ｌ ｎ ｔ ｅ ｇ ｏ ｔ 、 ｍｏ ｐ ｏｏ ｙ ａ ｄ ｍｅ ａ ｏ ｉｍ ｆｈ ｐ ｔ ｃ ｔ ． Ｍｅ ｈ ｄ Ｉ —ｓ ｕ Ｉ ｏ ｌ． ｕ Ｋｕ ｆ ｅｌ ｏ ｒ ｗ ｈ ｅ ｓ ｈ ｒ ｈ ｌｇ ｎ ｔｂ ｌ ｓ ｏ ｅ ａｏ ｙ ｅ ｔｏ ｓ ｎ ｉ Ｖ ｃ ｌ ｔ ａ
两 种 细胞 单 独 培 养 、肝 细 胞 与 Ｋ ｐ ｅ 细胞 按 ６ １比例 共 同 培 养 ，观 察 不 同 情 况 下 肝 细 胞 生 存 时 间 和 形 态 ，检 ｕｆｒ ：
小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨
小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨【摘要】目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。
方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。
结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。
结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。
【关键词】肝；枯否细胞；离心法，梯密度；小鼠，近交BABLc ；细胞分离肝Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。
肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。
近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。
如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。
而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。
本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。
试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。
1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES （美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI��1640培养基（美国Gibco公司）。
小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨
化 、 连 续 密 度梯 度离 心 、 择 性 贴 壁 三 步 法 分 离 Ｋ 并 比较 链 霉 蛋 白酶 、 不 选 Ｃ， Ⅳ型 胶 原 酶 及 联 用链 霉 蛋 白酶 和 Ⅳ 型胶 原 酶 等 ３ 不 同酶 消 化 分 离 方 法 所 得 ＫＣ得 率 及纯 度 。 结 果 ３种 不 同 酶 消 化 分 离 方 法 细胞 得 率 分别 为 （ ． ２ 种 ６ ３
龄 ， 洁级 ， 四Ｊ 大 学 华 西 医 学 中心 试 验 动 物 中 清 由 Ｉ ｌ 心提供 （ 可证 号 ：４ ） 许 ０ ６ 。试 验 前禁 食 １ ， ２ｈ 自由饮
水， 随机 分为 ３组 。
配 制 ，． ２ ｍ 滤 器 过 滤 除 菌 ， ０ ２ 临用 前 加入 ｌ 新 Ｏ， ９ ６ 鲜 灭活 的小牛血 清 ， 霉 素 １ ０Ｕ／ 青 ０ ｍＬ， 霉 素 １ ０ 链 ０
２ｍ Ｌ；
１ １４ Ｓ Ｓ液 的配 制 １ ０／ ｅｃ ｌ 液 和 ８ ５ ． ． Ｐ ０ Ｐ ｒｏｌ ９ ６ ．％
ＮＳ以 ９： １的 比例 混 合 ， 制成 Ｓ Ｓ原 液 ； ７ 配 Ｐ 以 ０ Ｐ ｒｏｌ ２ｍＬ配 制 ： Ｐ ． ｅｃ ｌ液 Ｓ Ｓ１ ４ｍＬ和 Ｐ Ｓ０ ６ｍＬ Ｂ ．
２ ｍＬ。酶 消化液 ： ０ ０ Ｉ 型胶原 酶 ２ｍＬ 方法 含 ．５ Ｖ ；
免疫 调节作 用 ， 时影 响 肝 细 胞 、 脂 细胞 及 内 皮 同 贮 细胞 的生物学 功能 ［ 。近期 发 现 ＫＣ能 诱导 同种 异 １ ］
体 Ｔ淋 巴细胞凋 亡 ， 在调 节 肝移 植 免 疫耐 受 中发 挥
士０ ５ × １ ｇ 。（ ． ６ ０ ４ ×１ － ，１ ． 士０ ７ ×１ ＿ ； 胞 纯 度 分 别 为 （ ３ ２ １ ７ ％ ，９ ． 士 １５ ， ．） ０ － ．３ ６ ± ． ） ０ｇ 。（０ ３ ． ） ０ ｇ 。细 ９ ． 士 ． ） （０ ７ ． ）
Kupffer细胞
Kupffer 细胞Kupffer 细胞（Kupffer cells，KC）是位于肝血窦内的巨噬细胞,寄居于肝血窦内皮细胞之间或之上,是体内固定型巨噬细胞中最大的群体。
约占巨噬细胞总数的80%。
KC体积较大，呈阿米巴状，有多个膜性突起，并可通过突入内皮细胞下Disse间隙的突起与肝细胞直接接触；细胞核大而圆；胞浆丰富，内含大量核糖体和吞噬体，有发达的内质网、高尔基体和分泌型囊泡。
激活的KC变圆，去极化，细胞表面皱缩，脱颗粒，失去伪足，胞内出现许多吞噬溶酶体和透明的空泡。
一些激活的KC内还含有致密物质。
随KC激活后吞噬功能的增强，胞内还会出现一些碎片和破损的红细胞。
一、KC的表面受体和标志人类和小鼠的KC的表面受体和标志同一般单核巨噬细胞的表面标志基本一致，每一种表面受体均与其功能密切相关：1．甘露糖受体（mannose receptor）：能与微生物表面的糖蛋白或类似酵母颗粒样物结合，促进胞吞作用；2．脂多糖（LPS）/LPS结合蛋白（LPS binding protein）复合物受体（CD14）：能够与革兰氏阴性细菌表面物质LPS或与LPS结合蛋白组成的复合物相结合，在LPS的信息传递中起启动作用，与KC的激活及对细菌的清除能力有关；3．三种不同IgG的Fc受体，FcγⅠR（CD64），FcγⅡR（CD32），FcγⅢR（CD16）：在启动细胞外杀伤、调理素化和胞吞中发挥作用；4．补体受体-1（CR1，CD35），补体受体-3（CR3，C3biR，CD11b）：CR1与细胞吞噬微生物有关；CR3与LFA-1（CD11a）和CD11c 一起在细胞的粘附中发挥作用；5．其他表面分子：如CD13、CD15、CD68和VLA-4（CD29/CD49d）等；6．KC表面还带有Ia抗原，因而具有抗原呈递作用。
二、KC主要的生物学功能1．胞吞作用：由于KC所处的解剖位置，使其能够与许多经过门静脉而来的潜在有害物直接接触，如微生物、内毒素、衰老或破裂的细胞等。
大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响(医药类)
大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响（医药类）目的观察大鼠肝实质细胞和枯否细胞共培养对其体外生长、形态和功能的影响方法采用原位两步ⅳ型胶原灌注法和高密度离心法分离大鼠肝实质细胞和枯否细胞。
在体外，肝实质细胞和枯否细胞以6∶1的比例共培养。
观察不同条件下肝细胞的存活时间和形态。
培养36 h 后，每隔24 h检测上清液中白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平，用放射免疫法检测上清液中白细胞介素1 (IL 1)、白细胞介素6 (IL 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)的含量。
结果分离培养组肝细胞生长增殖迅速，并向正常肝细胞进化。
肝细胞可以培养并存活15天。
共培养组肝细胞生长和增殖缓慢，可存活10天。
24、36、48和60 h时，共培养组上清液白蛋白水平低于单培养组(t = 2.551 ~ 3.139，P0.05)；24小时、36小时、48小时和60小时血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平高于单独培养组(T = 2.446 ~ 3.108，P0.05)；共培养组的枯否细胞维持il1、il6和tnfα的分泌功能，而单培养组则未检测到il1、il6和tnfα。
结论大鼠枯否细胞和肝实质细胞可以在合适的培养条件下共培养。
这两种细胞能保持良好的分泌功能，可用于实验研究。
[关键词]肝细胞；枯否细胞；共培养技术；白蛋白；细胞因子。
大鼠[摘要]目的观察生长情况。
和肝细胞功能的影响。
方法采用原位ⅳ型胶原酶两步灌注法和超临界流体低速离心法分别分离大鼠肝实质细胞(PHC)和枯否细胞。
PHC细胞和库普弗细胞按6∶1的比例进行体外共培养。
观察细胞在不同条件下的存活时间和形态。
培养上清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶在24小时检测一次，36小时用放射免疫法测定白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的浓度。
结果单独培养组肝细胞生长迅速，发育成正常肝细胞，可存活15天；对于共培养组，细胞生长和生成缓慢，存活10天。
大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现
大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现毛德文;裴燕燕;王明刚【摘要】枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联.Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍.课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_pLenti-GFP-IRES-SV40LT表达载体,包装形成慢病毒颗粒侵染Kupffer 细胞,侵染后细胞生长速度变快,能多次传代,细胞状态稳定,巨噬细胞特异性标志F4/80呈阳性表达.将SV40LT片段导入Kupffer细胞可实现细胞永生化,且转染后的kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)012【总页数】3页(P35-37)【关键词】Kupffer细胞;SV40-LT片段;永生化;特性【作者】毛德文;裴燕燕;王明刚【作者单位】广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023【正文语种】中文【中图分类】Q2;R57枯否细胞（Kupffer cells，KC）是定植在肝脏的巨噬细胞，是肝脏非实质细胞的重要组成部分。
Kupffer细胞在肝脏固有免疫系统中发挥关键作者，是肝脏免疫防御的第一道防线。
Kupffer细胞与慢性肝炎、肝硬化及肝癌等多种肝脏疾病密切关联。
有效、快速分离Kupffer细胞，针对性开展功能与机制研究是探明不同致病因素对 Kupffer细胞影响及其与疾病相关性的基石。
但Kupffer细胞分离纯化技术要求较高，且关键在于Kupffer细胞分化增殖能力极弱，成为开展大规模细胞实验的主要障碍，课题组在实验中分离纯化了Kupffer细胞，且构建了一种永生化的细胞模型。
相关报道如下。
Wistar大鼠，SPF级，雄性，200～250g购于广西医科大学动物实验中心提供（SCXX桂2003-0001）。
肝癌中肝Kupffer细胞的作用
肝癌中肝Kupffer细胞的作用肝癌是一种对人类健康构成严重威胁的肿瘤疾病，因其发展快速且难以治愈，常常被称为“癌症之王”。
肝Kupffer细胞是肝脏中最常见的巨噬细胞，它们在肝癌发展中扮演着重要的作用。
本文将介绍肝Kupffer细胞的作用和相关的治疗手段，分析它们在肝癌治愈中的潜力。
一、Kupffer细胞的基本概述Kupffer细胞主要位于肝脏内窦壁和肝淋巴组织中，它们是一种主动的、有吞噬作用的巨噬细胞，具有清除体内病原体和异物等功能。
Kupffer细胞能够通过吞噬和分解血液中过多的细胞碎片和垃圾，在清除体内有害物质方面发挥了重要作用。
二、Kupffer细胞在肝癌中扮演的角色在肝癌发展过程中，Kupffer细胞可以发挥重要的抗癌作用。
Kupffer细胞能够分泌多种细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6等，这些细胞因子能够刺激免疫细胞的活性，从而发挥抗肿瘤的作用。
Kupffer细胞还能够通过与其他免疫细胞的相互作用，控制肝癌的发展。
在肝癌诱导期间，它们可以产生多种因子分子如MIP-2、CCL5和MCP-1，吸引其他免疫细胞的积极参与阻止肝癌细胞的扩散和增殖。
Kupffer细胞还可以识别并攻击病毒性感染细胞。
研究发现，在病毒感染的肝脏中，Kupffer细胞的数量会增加，从而带动免疫系统，抵抗病毒侵袭，从而降低肝癌几率。
三、Kupffer细胞和肝癌治疗针对Kupffer细胞在肝癌中重要的作用，人们发展了一系列利用Kupffer细胞治疗肝癌的策略。
比如，研究人员在实验室中体外培养Kupffer细胞，并注射到肝癌患者体内，发现能够明显地抑制肝癌的增殖和扩散。
此外，人们还尝试了利用Kupffer细胞作为细胞靶向治疗肝癌的手段。
例如，在人工实验中，研究人员成功制造了一种能够特异性地将Kupffer细胞标记的诊断靶向药物，可以提高治疗的精确性和效果，从而取得经济与社会效益的双重提升。
虽然Kupffer细胞在肝癌治疗中有重要作用，但考虑到Kupffer细胞的数量少、质量不足，尚不成熟的科技难度等问题，Kupffer细胞在治愈肝癌中的现实应用还需要进一步探究，异步协同才能达到最佳肝癌治疗效果。
一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法
一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法张哲;赵曙光;倪阵;刘震雄;唐华;李慧艳;闻勤生【摘要】目的观察改良大鼠肝脏Kupffer细胞 (KCs) 分离方法获取KCs的效果.方法参照Akira提供的方法进行以下改进:① 前灌注液在体灌注,Ⅳ型胶原酶离体灌注消化;② Percoll分离液不连续密度梯度离心;③台盼蓝染色检测分离细胞的活度;④选择性贴壁法纯化获取的细胞;⑤ 吞墨实验、DAB染色及CD163细胞免疫荧光法鉴定所分选细胞.结果肝脏KCs的获得量为(3±1.5)×105/g鼠肝,细胞活度＞92%;光镜下细胞呈圆形,培养24 h后呈梭形或多角形;具有较强的吞噬能力,DAB染色呈"煎蛋"样,荧光显微镜下＞99%为KCs.结论改良的大鼠肝脏KCs分离方法较Akira法能够获取更高纯度的KCs,简捷经济,值得推广.%Objective To observe the isolation effect of kupffer cells (KCs) by an improved isolation method of KCs from a single rat liver. Methods The isolation method was based on Akira' s method with some improvements as followed : ① After primarily perfused in vivo, the liver was perfused with collagens type Ⅳ and digested in vitro; ② Discontinuous density gradient centrifugation in Percoll was used; ③ The viability of isolated cells were determined by trypan blue staining; ④ The purification of isolated cells by selective cell adherence; ⑤ Phagocytosis test , DAB dyeing and CD163 immunofluorescence staining were used to identified isolated KCs. Results The number of acquired cells was (3 ±1.5) x 105 per gram rat liver, and the viability of cells was more than 92%. The morphology of cells was roundness, and became spindle or polygonal after 24 h cultured. The cell had strong phagotrophic ability, and appeared "fried eggs" by DAB dyeing.More than 99% cells were identified as KCs by immunofluorescence staining. ConclusionrnThe improved isolation method of KCs is more productive of high purity of KCs, it is simple and economic.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2012(021)011【总页数】5页(P1060-1064)【关键词】Kupffer细胞;细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】张哲;赵曙光;倪阵;刘震雄;唐华;李慧艳;闻勤生【作者单位】第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038【正文语种】中文【中图分类】R575.5肝脏细胞包括实质细胞和非实质细胞，非实质细胞约占肝脏细胞总数的10%，其中肝脏巨噬细胞(kupffer cells，KCs)的比例约为33%。
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• PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀 释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
非肝细胞SIP离心准备SIP Nhomakorabea心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。 取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去 除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒 然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋， 陈琦，等同学。
• 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍， 弃上清(300×g，5min)。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清 （HyClone）。
2天及3天KCs
2周及3周KCs
KCs的鉴定活力判定
• 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的24
孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)， 2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功 能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 • F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定 KCs（大鼠）,阳性为KCs。
肝脏巨噬细胞(KCs)的分离 与培养
研究生：魏思东 戴卓娅 导师： 龚建平
2010-05-04
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白 色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。