Kupffer_细胞_分离_培养

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肝脏基础知识与肝间充质细胞制备

肝靠近腹腔的一面叫肝面，脏面中部有略呈 “H”形的三条沟，中间横行的沟又称肝门，有肝左、右管。肝固有动脉左、右支，肝门静脉左、右支和肝的神经、淋巴管由此进入。左侧的纵沟较窄而深，沟的前部有肝圆韧带通过，称肝圆韧带支，肝圆韧带由胎儿时期的脐静脉闭锁而成,经肝镰状韧带的游离缘内行致脐。后部容纳静脉，称静脉韧带裂。肝面分为4个叶：肝左叶位于肝圆韧带左侧，肝右叶位于胆囊窝与腔静脉右侧，方叶位于肝门前，胆囊窝与肝圆韧带之间，尾状叶位于肝门之后，静脉韧带裂与腔静脉沟之间。
离心淘洗技术是根据反向流动离心原理设计的。在整个离心淘洗过程中 ,淘洗室内悬浮液中的细胞受到两个相反方向的力:离心力(离心转速)和向心力(泵控流速) 并处于平衡状态。当淘洗室内悬浮液往离心转轴方向流动时，随着淘洗室壁逐渐变宽，悬浮液流速逐渐变慢，这样就形成了一个速度梯度；从离心转轴近端至远端，离心力逐渐增大，也形成一个速度梯度，这两者刚好相反。沉降速度跟细胞大小和密度有关，体积、密度较小的细胞由于沉降速度低先被洗脱出来，较大的细胞由于沉降速度高则滞留在淘洗室入口，这里流速和转速都很高；体积、密度中等的细胞则在淘洗室壁最宽处保持平衡。离心力不变时 ,通过增加淘洗液的流速可以使体积、密度大的细胞也被淘洗出来。
2、肝腹面
二、肝的功能肝脏是人体中最大的腺体，也是最大的实质性脏器，约占体重的1/40～1/50。肝的功能极其复杂，参与多种有机物合成以及休内物质的分解代谢，主要功能如下：第一解毒功能。
第二代谢功能
第三分泌胆汁。第四造血、储血和调节循环血量的功能。第五免疫防御功能。第六肝脏再生功能。
3.2肝间充质干细胞制备
取出肝脏
剪碎组织
离心去红

211246889_Kupffer细胞在肝脏NK细胞亚群稳态维持和分化成熟中的作用探究

Kupffer 细胞在肝脏NK 细胞亚群稳态维持和分化成熟中的作用探究①张新宇陈雅雯陈永艳田志刚彭慧（中国科学技术大学免疫学研究所，合肥 230027）中图分类号 Q28 文献标志码 A 文章编号 1000-484X （2023）05-0897-07［摘要］目的：探究Kupffer 细胞对肝脏NK 细胞的调控作用。

方法：利用荧光成像技术分析小鼠Kupffer 细胞和肝脏NK 细胞的位置关系；通过注射氯磷酸盐脂质体构建体内清除Kupffer 细胞模型，流式分选去除肝脏非实质细胞中的Kupffer 细胞进行体外共孵育实验；通过抗生素水饲喂清除小鼠肠道共生菌；利用流式细胞术分析肝脏NK 细胞亚群的比例、数量和成熟状态。

结果：稳态下Kupffer 细胞和肝脏NK 细胞存在共定位，清除Kupffer 细胞后肝脏驻留NK 细胞和经典NK 细胞数量减少；体内清除和体外共培养实验证实Kupffer 细胞可促进肝脏驻留NK 细胞和经典NK 细胞的成熟，而抗生素处理过的小鼠在清除Kupffer 细胞后，肝脏NK 细胞亚群的数量和成熟状态无显著变化。

结论：Kupffer 细胞有利于肝脏NK 细胞的数量维持，且以共生菌依赖的方式促进肝脏NK 细胞的成熟分化。

［关键词］肝脏NK 细胞；Kupffer 细胞；共生菌Roles of Kupffer cells in homeostatic maintenance and differentiation and maturation of liver NK cell subsetsZHANG Xinyu ， CHEN Yawen ， CHEN Yongyan ， TIAN Zhigang ， PENG Hui. Institute of Immunology ， University of Science and Technology of China ， Hefei 230027， China［Abstract ］ Objective ：To explore the regulation of liver NK cells by Kupffer cells. Methods ：Fluorescence imaging technology was used to analyze the positional relationship between mice Kupffer cells and liver NK cells. Kupffer cell depletion in vivo was estab⁃lished by injecting clodronate liposomes. The liver non -parenchymal cells without Kupffer cells used in co -culture experiments in vitro were obtained by using fluorescence -activated cell sorting. Mice were fed with antibiotics in the drinking water to deplete microbiota. Theproportion ， number and maturation of liver NK cell subsets were analyzed by flow cytometry. Results ：There is colocalization between Kupffer cells and liver NK cells at steady state ； depletion of Kupffer cells leads to decreased number of liver -resident NK and conven⁃tional NK cells ； Kupffer cells promote the maturation of liver -resident NK and conventional NK cells ， which was confirmed by deple⁃tion experiments in vivo and co -culture experiments in vitro ； however ， depletion of Kupffer cells in antibiotic -treated mice led to no significant changes in the number and maturation of liver NK cell subsets. Conclusion ：Kupffer cells contribute to the maintenance of liver NK cells and promote the maturation of liver NK cells in a microbiota -dependent manner.［Key words ］ Liver NK cells ；Kupffer cells ；Microbiotadoi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.05.001①本文为NSFC 重大研究计划项目（92042305）；国家重点研发计划项目（2022YFC2304502，2020YFA0804100）。

大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究

朱强 ¨，韦嘉 ¨，黄富礼，董坚”，刘怀鄂 ”，江元森
（）昆明医学院第一附属医院感染疾病科，云南昆明１
６０３；５０２
２泸州医学院附属医院感染病科，四川泸州６６０；）４００
３昆明医学院第一附属医院生物治疗科，云南昆明６０３；）５０２４）中山大学附属第三医院感染病科，广东广州５０３）１６０
需进一步优化．
［关键词］肝细胞；Ｋｐｅ细胞；共培养ｕｆｒ［中图分类号］Ｒ２．８［３９２文献标识码］Ａ［文章编号］１０４０（０７４— ０５— ５０３— ７６２０）００３０
Ｃｏ — ｃｌｕｒｆＨｅａｏｙｅ，ＫｕｅｌｏＤｔｉｔｏｕｔｅｏｐｔｃｔｓｆｒＣｅｌｆＳＲａｎＶｉｒ
［ｂｔａｔＡｓｃ］ＯｂｅｔｅＴｒｕｈＣ —ｃｌｒＫｐｅｅｓｗｔｅａｏｙｎｖｔ．ｔｕｄｒｔｄｔｅｉ— ｒｊｃｉｈｏｇＯｕｔｅｕｆｒｌｉｈｐｔｔｉｉｏｏｎｅｓｎｎｖｕｃｌｈｃｅｒａｈ
ｌｎｅｏｆｅｃｆｐｆｒｃｌｎｔｅｇｏｔ、ｍｏｐｏｏｙａｄｍｅａｏｉｍｆｈｐｔｃｔ．ＭｅｈｄＩ —ｓｕＩｏｌ．ｕＫｕｆｅｌｏｒｗｈｅｓｈｒｈｌｇｎｔｂｌｓｏｅａｏｙｅｔｏｓｎｉＶｃｌｔａ
两种细胞单独培养、肝细胞与Ｋｐｅ细胞按６１比例共同培养，观察不同情况下肝细胞生存时间和形态，检ｕｆｒ：

Kupffer细胞分离培养

• 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞筛过滤。
• PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
非肝细胞SIP离心准备SIP Nhomakorabea心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋，陈琦，等同学。
• 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍，弃上清(300×g，5min)。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清（HyClone）。

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨

化、连续密度梯度离心、择性贴壁三步法分离Ｋ并比较链霉蛋白酶、不选Ｃ， Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和 Ⅳ 型胶原酶等３不同酶消化分离方法所得ＫＣ得率及纯度。结果３种不同酶消化分离方法细胞得率分别为（．２种６３
龄，洁级，四Ｊ大学华西医学中心试验动物中清由Ｉｌ心提供（可证号：４）许０６。试验前禁食１，２ｈ自由饮
水，随机分为３组。
配制，．２ｍ滤器过滤除菌，０２临用前加入ｌ新Ｏ，９６鲜灭活的小牛血清，霉素１０Ｕ／青０ｍＬ，霉素１０链０
２ｍＬ；
１１４ＳＳ液的配制１０／ｅｃｌ液和８５．．Ｐ０Ｐｒｏｌ９６．％
ＮＳ以９：１的比例混合，制成ＳＳ原液；７配Ｐ以０Ｐｒｏｌ２ｍＬ配制：Ｐ．ｅｃｌ液ＳＳ１４ｍＬ和ＰＳ０６ｍＬＢ．
２ｍＬ。酶消化液：００Ｉ型胶原酶２ｍＬ方法含．５Ｖ；
免疫调节作用，时影响肝细胞、脂细胞及内皮同贮细胞的生物学功能［。近期发现ＫＣ能诱导同种异１］
体Ｔ淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥
士０５ × １ｇ。（．６０４ ×１－，１．士０７ ×１＿；胞纯度分别为（３２１７％，９．士１５，．）０－．３６ ± ．）０ｇ。（０３．）０ｇ。细９．士．）（０７．）

大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响(医药类)

大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响（医药类）目的观察大鼠肝实质细胞和枯否细胞共培养对其体外生长、形态和功能的影响方法采用原位两步ⅳ型胶原灌注法和高密度离心法分离大鼠肝实质细胞和枯否细胞。

在体外，肝实质细胞和枯否细胞以6∶1的比例共培养。

观察不同条件下肝细胞的存活时间和形态。

培养36 h 后，每隔24 h检测上清液中白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平，用放射免疫法检测上清液中白细胞介素1 (IL 1)、白细胞介素6 (IL 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)的含量。

结果分离培养组肝细胞生长增殖迅速，并向正常肝细胞进化。

肝细胞可以培养并存活15天。

共培养组肝细胞生长和增殖缓慢，可存活10天。

24、36、48和60 h时，共培养组上清液白蛋白水平低于单培养组(t = 2.551 ~ 3.139，P0.05)；24小时、36小时、48小时和60小时血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平高于单独培养组(T = 2.446 ~ 3.108，P0.05)；共培养组的枯否细胞维持il1、il6和tnfα的分泌功能，而单培养组则未检测到il1、il6和tnfα。

结论大鼠枯否细胞和肝实质细胞可以在合适的培养条件下共培养。

这两种细胞能保持良好的分泌功能，可用于实验研究。

[关键词]肝细胞；枯否细胞；共培养技术；白蛋白；细胞因子。

大鼠[摘要]目的观察生长情况。

和肝细胞功能的影响。

方法采用原位ⅳ型胶原酶两步灌注法和超临界流体低速离心法分别分离大鼠肝实质细胞(PHC)和枯否细胞。

PHC细胞和库普弗细胞按6∶1的比例进行体外共培养。

观察细胞在不同条件下的存活时间和形态。

培养上清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶在24小时检测一次，36小时用放射免疫法测定白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的浓度。

结果单独培养组肝细胞生长迅速，发育成正常肝细胞，可存活15天；对于共培养组，细胞生长和生成缓慢，存活10天。

大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现

大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现毛德文;裴燕燕;王明刚【摘要】枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联.Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍.课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_pLenti-GFP-IRES-SV40LT表达载体,包装形成慢病毒颗粒侵染Kupffer 细胞,侵染后细胞生长速度变快,能多次传代,细胞状态稳定,巨噬细胞特异性标志F4/80呈阳性表达.将SV40LT片段导入Kupffer细胞可实现细胞永生化,且转染后的kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)012【总页数】3页(P35-37)【关键词】Kupffer细胞;SV40-LT片段;永生化;特性【作者】毛德文;裴燕燕;王明刚【作者单位】广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023【正文语种】中文【中图分类】Q2;R57枯否细胞（Kupffer cells，KC）是定植在肝脏的巨噬细胞，是肝脏非实质细胞的重要组成部分。

Kupffer细胞在肝脏固有免疫系统中发挥关键作者，是肝脏免疫防御的第一道防线。

Kupffer细胞与慢性肝炎、肝硬化及肝癌等多种肝脏疾病密切关联。

有效、快速分离Kupffer细胞，针对性开展功能与机制研究是探明不同致病因素对 Kupffer细胞影响及其与疾病相关性的基石。

但Kupffer细胞分离纯化技术要求较高，且关键在于Kupffer细胞分化增殖能力极弱，成为开展大规模细胞实验的主要障碍，课题组在实验中分离纯化了Kupffer细胞，且构建了一种永生化的细胞模型。

kupffer cell 标签

Kupffer细胞标签一、Kupffer细胞简介Kupffer细胞是肝脏内最大的巨噬细胞裙，起着维护肝脏内稳态、清除血液中有害微生物和代谢产物等重要作用。

Kupffer细胞表面上的标签物质能够帮助识别这些细胞，进而对其功能进行研究，这些标签通常包括对细胞表面特异抗体的染色等。

二、Kupffer细胞标签的种类1. CD68标签：CD68是一种已知的巨噬细胞特异性标记物，在研究Kupffer细胞时常用于标识细胞的存在和数量。

2. F4/80标签：F4/80是巨噬细胞的一种细胞表面抗原，也是Kupffer 细胞的特异性标记物质之一。

3. CD163标签：CD163是单核-巨噬细胞的特异性表面标记，在进行Kupffer细胞相关研究时也常作为标签使用。

三、Kupffer细胞标签在研究中的应用Kupffer细胞标签的运用能够帮助科研人员迅速、准确地定位和识别Kupffer细胞，从而更好地开展相关研究工作。

利用CD68标签可以帮助研究者检测和定量Kupffer细胞的数量变化，进而观察其在肝脏疾病中的变化规律；而借助F4/80标签则可以更好地观察Kupffer细胞在肝脏免疫反应中的作用。

四、Kupffer细胞标签在临床中的意义Kupffer细胞在肝脏疾病的发生和发展中扮演着重要角色，因此对其进行研究不仅有助于从分子水平揭示疾病发生的机制，还可为相关疾病的临床治疗提供依据。

Kupffer细胞标签的运用所得到的研究结果可以为实验室与临床间的桥梁，为肝脏病变的诊断与治疗提供新思路和方法。

五、结语Kupffer细胞标签的使用在相关研究和临床中具有重要意义，它为科研人员提供了更多的研究方法和手段，有助于更好地了解Kupffer细胞的生物学特性、功能以及在疾病发生发展中的作用，其应用前景广阔，也为相关临床治疗提供了新的研究思路。

希望未来能够有更多的相关研究者投入到这一领域的工作中，为Kupffer细胞及其相关疾病的研究和临床治疗做出更大的贡献。

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用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心ห้องสมุดไป่ตู้
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。
• 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）试管，轻轻的沿着管加 2mL25 ％的 SIP 细胞悬液（小鼠 2 管，大鼠 4
管）。
• 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用 PBS离心清洗 2遍，
弃上清(300×g，5min)。
非肝细胞SIP离心准备
SIP离心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按 5x105/ml 浓度种植于培养板中，培养 2h 。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋，陈琦，等同学。 • 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
肝脏巨噬细胞(KCs)的分离与培养
研究生：魏思东戴卓娅导师：龚建平
2010-05-04
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。 • 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞筛过滤。 • PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
2周及3周KCs
KCs的鉴定活力判定
• 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的 24
孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，
2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功
能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 • F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定 KCs（大鼠）,阳性为KCs。
取出培养板，用 37℃ 的 PBS 液轻轻冲洗 3 次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
培养基配方为 DMEM （ H ） + 双抗 +10% 胎牛血清
（HyClone）。
2天及3天KCs