细胞分离与培养技术
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
细胞生物学实验技术
细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术是现代生命科学研究中的关键环节，它为研究人员提供了深入了解细胞结构、功能和相互作用的途径。
本文将重点介绍一些常见的细胞生物学实验技术，包括细胞培养、染色技术、分离技术和显微镜观察等。
一、细胞培养技术细胞培养是一项基础性技术，它可以将细胞从体内取出并在适当的培养基中进行增殖和维持。
细胞培养的首要任务是提供适当的培养基，其中含有必需的营养物质、生长因子和适当的温度、湿度和气体条件。
细胞培养技术广泛应用于细胞生物学实验、组织工程、药物研发等领域。
二、染色技术染色技术是细胞生物学实验中常用的方法之一，它使研究者能够对细胞内各种结构和分子进行可视化观察。
常用的染色方法包括荧光染色、酶标染色和核酸染色等。
荧光染色利用荧光标记的抗体或染料，可使特定的细胞结构或分子在显微镜下发出荧光信号，从而观察其位置和表达水平。
酶标染色则通过酶与底物的反应，使细胞或组织显示出颜色等信号。
核酸染色则利用特定染料与细胞核酸结合，以观察DNA或RNA的分布情况。
三、分离技术分离技术在细胞生物学实验中具有重要作用，它可以将不同类型的细胞或细胞组分进行分离和纯化。
常用的分离技术包括细胞离心、流式细胞术和免疫磁珠分离等。
细胞离心是通过离心机将混合细胞悬液分离成上清液和沉淀，从而获得纯化的特定类型细胞。
流式细胞术则通过流式细胞仪测量细胞的大小、形态和表面标记物，从而实现对细胞的高通量分离和分析。
免疫磁珠分离则利用特定抗体结合在磁珠表面，以实现对需要纯化的细胞或细胞组分的选择性捕获。
四、显微镜观察显微镜观察是细胞生物学实验的重要手段，它使研究者能够观察到细胞内不同的结构和过程。
传统光学显微镜可实现对细胞形态和部分细胞器的观察，但其分辨率有限。
近年来，随着超分辨显微镜技术的发展，研究者们能够突破传统光学显微镜的分辨率极限，实现对亚细胞结构和分子过程的观察。
总结细胞生物学实验技术在现代生命科学研究中发挥着至关重要的作用。
人类肝细胞的分离与培养技术
人类肝细胞的分离与培养技术随着生命科学的发展和进步，肝细胞的分离和培养技术在医学领域中越来越重要。
肝细胞作为机体内代谢和解毒的重要器官，它的功能对于人体的健康具有至关重要的影响。
因此，肝细胞的活体分离和培养技术是研究肝脏生理、病理机理及其相关疾病的重要手段之一，也是研发肝药和治疗肝病的重要基础。
一、肝细胞的分离技术1.灭菌准备分离和培养肝细胞必须有高质量的培养基和相关配件，因此必须进行严格的灭菌准备工作。
需要准备无菌离心管和培养皿、无菌试管、无菌针头等，以保证分离后的肝细胞有良好的生长环境。
2.胶原酶消化胶原酶是一种生物碱性蛋白酶，它可以使肝细胞在本身结构上受到的伤害最小，分离出的细胞也更加健康、完整。
使用胶原酶消化，可以将肝脏组织中的各类细胞分离出来，与此同时，有的组织中存在黏性蛋白质，加胶原酶后，可以有效地降低分离的黏性蛋白质含量，使其在分离过程中保持较好的完整性。
3.密度梯度离心密度梯度离心是将分离出来的细胞通过离心机离心处理，得到纯化的细胞组织。
将经胶原酶消化的混合细胞悬液注入含有石蜡或离子聚合物化合物的密度梯度管中，通过逐层离心，不断离心分离出不同密度的细胞。
二、肝细胞的培养技术肝细胞的分离与培养是肝研究的重要手段之一，为了成功地分离和培养肝细胞，还需要具备有效的培养技术。
以下是几种比较常见的肝细胞培养技术。
1.原代细胞培养原代细胞培养即从肝脏中取出肝细胞，以生理盐水或PBS等缓冲液洗涤去除血液和淋巴细胞，将肝组织制成细胞悬浮液，然后将细胞悬浮液转移到含有血清的培养基中培养。
初期内，细胞只能在特殊的培养条件下存活，随着时间的推移，细胞的生长速度会逐渐加快，直到与原始肝细胞达到一致。
2.选循环细胞培养选循环细胞培养技术是将同样的原代肝细胞在培养后进行染色体检测，并筛选出较好的染色体数量的细胞进行扩增。
通过筛选出的具有较好生长速度和菌礼细胞染色体形式的细胞进行扩张和培养。
3.分化诱导培养分化诱导培养技术是将原代肝细胞和不同化学物质进行共培养，从而使肝细胞分化为肝小叶细胞或胆汁细胞，为肝细胞研究提供了更加相应的模型。
细胞培养技术中的细胞纯化和分离
细胞培养技术中的细胞纯化和分离随着生物技术和生物医学研究的不断发展，细胞培养技术也越来越成为一种重要的研究手段。
在进行细胞培养实验时，不仅需要在培养基中提供适宜的营养条件，还需要考虑如何保证细胞的纯度和分离。
因为如果细胞混合在一起，可能会对实验结果产生干扰，影响科学研究成果的准确性。
细胞纯化和分离技术的发展，为细胞培养实验提供了有力的支持。
一、细胞纯化技术所谓细胞纯化，即是指将同一类型的细胞从混合物中分离出来，获得纯种的细胞。
这种技术应用广泛，例如在干细胞研究中，需要将干细胞从其他细胞中纯化出来。
目前常用的细胞纯化技术主要有以下几种。
1.差速离心这种方法的原理是依靠细胞的不同沉降速度，在其它细胞和细胞碎片中分离出要纯化的细胞种类。
比如对于混合的细胞，进行差速离心后，重的细胞如肝细胞等就可以在离心管的底部沉淀下来；而轻的细胞比如造血干/祖细胞则可以在上层沉淀。
这种方法虽然方便快捷，但是由于离心速度的不同，有时会把不同的细胞类型离心到一个位置，分离效果并不理想。
2. 细胞排序技术细胞排序技术是一种可接受的方法。
这种方法利用一种叫做细胞分选仪（FACS）的设备来实现，FACS通过运用激光束可以捕捉到被染色的细胞，然后在细胞上打标签，这样细胞分选仪就能帮助实验人员将目标细胞分选出来。
不仅如此，FACS还可以根据设定的特定标记，为不同细胞类型分类和分选。
但是，这种方法价格昂贵，需要训练技能，限制了它的使用。
二、细胞分离技术与细胞纯化技术不同，细胞分离技术是将混合物中的不同细胞种类分离的过程。
这种技术在体外培养单一细胞的物种和组织研究中应用广泛。
1. 磁珠细胞分离技术这种技术广泛应用在制备纯化细胞的过程中。
基本原理是通过对细胞标记来实现磁性分离。
首先，将细胞和磁性珠以特定的方式结合在一起，对此进行特别处理，这样可以使细胞在磁场中受到磁力吸引。
然后，将细胞和磁珠贴附在磁性离心离心机上，以达到将细胞分离的目的。
各种免疫学方法
各种免疫学方法
免疫学中有很多种方法，以下列举其中一些：
1. 免疫细胞分离和培养：通过离心和分层技术，可以从体内分离出免疫细胞，如淋巴细胞、单核细胞等，并在体外培养它们以进行后续实验。
2. 免疫组化和免疫荧光：这些技术用于检测和定位免疫细胞和抗原在组织中的分布。
通过使用特定的抗体标记，可以在显微镜下观察到这些标记物。
3. 流式细胞术：这是一种常用的技术，用于分析和鉴定免疫细胞的表型和功能。
通过使用荧光标记的抗体，可以通过流式细胞仪检测和分离特定的细胞亚群。
4. 免疫沉淀和免疫印迹：这些技术用于检测和分离特定的蛋白质。
通过与目标蛋白质特异性结合的抗体，可以将其从复杂的混合物中分离出来，并通过免疫印迹技术进行检测。
5. 免疫基因学：这是通过研究免疫相关基因的表达和功能来了解免疫系统的方法。
包括使用PCR、实时荧光定量PCR和基因敲除等技术。
6. 酶联免疫吸附试验：这是一种常用的免疫学检测方法，通过将待测抗原或抗体与酶结合，再利用酶的催化作用对待测抗原或抗体进行放大信号反应，以提高检测的灵敏度。
7. 血清凝集试验：这是一种检测抗原或抗体的方法，通过将待测血清与已知抗原或抗体在体外进行反应，观察是否发生凝集现象来判断待测血清中是否存在相应的抗原或抗体。
8. 补体激活试验：这是一种检测补体系统活性的方法，通过观察补体系统被激活后对病原微生物的杀伤作用来评估机体的免疫功能。
9. 疫苗接种：通过接种疫苗来激发机体产生特异性免疫反应，以提高机体的免疫力，预防相应的疾病。
以上各种免疫学方法各有特点，适用于不同的应用场景。
在实际应用中，应根据具体情况选择合适的方法。
获得微生物纯培养的方法
获得微生物纯培养的方法微生物纯培养是指通过分离和纯培养微生物细胞或菌体,获得所需微生物的纯品。
获得微生物纯培养的方法可以有多种,下面介绍其中两种常见的方法。
方法一:细胞分离法细胞分离法是获得微生物纯培养的常用方法之一。
该方法通常分为以下几个步骤:1. 培养基制备:将微生物所需的培养基制成浓度适宜的培养基,并加入适量的营养物质和抗生素等调节剂。
2. 细胞采集:将制备好的培养基进行细胞采集,通常采用离心技术或显微镜观察等方法。
3. 细胞分离:将采集到的细胞通过物理或化学方法进行分离,如过滤、洗涤、离心等,获得不同种类的细胞。
4. 纯培养:将分离得到的细胞进行纯培养,通常需要使用适当的技术和设备,如酒精沉淀、磁选、过滤等,确保获得纯品。
细胞分离法的优点在于操作简单、结果可靠,但需要选择合适的培养基和分离条件,对分离细胞的种类和数量有一定的要求。
方法二:化学分离法化学分离法是指利用微生物细胞或菌体表面的化学特征进行分离的方法。
该方法通常分为以下几个步骤:1. 培养基制备:将微生物所需的培养基制成浓度适宜的培养基,并加入适量的营养物质和抗生素等调节剂。
2. 添加化学分离剂:根据不同的化学分离剂,对培养基中的微生物细胞或菌体进行干扰,使它们分离出来。
常用的化学分离剂包括酸碱、盐、有机溶剂等。
3. 细胞分离:将添加化学分离剂的培养基进行细胞分离,通常采用离心技术或显微镜观察等方法。
4. 纯培养:将分离得到的细胞进行纯培养,通常需要使用适当的技术和设备,如酒精沉淀、磁选、过滤等,确保获得纯品。
化学分离法的优点在于能够精确地控制分离条件,分离出不同种类的微生物,但需要选择合适的化学分离剂和分离条件,对分离细胞的种类和数量有一定的要求。
细胞生物学的实验方法与技巧
细胞生物学的实验方法与技巧细胞生物学是研究细胞结构和功能的科学领域。
在细胞生物学中，实验方法和技巧是非常关键的。
细胞生物学的实验技术涉及到多种技术和方法，包括细胞培养、细胞分离、荧光显微镜、分子生物学等等。
在本文中，我们将会详细讨论细胞生物学中的实验方法和技巧。
一、细胞培养技术细胞培养技术是研究细胞生长、增殖、衰老等生理状态的一种重要的实验技术。
细胞培养技术通常需要使用一个适宜的培养基，该培养基还需要添加适当的营养物质和培养物质。
在培养细胞时，需要注意适宜的温度、湿度、和二氧化碳含量等因素，这些因素可以影响细胞的状态和生命活动。
另外，在细胞培养中，不可避免地会遇到一些问题，例如细胞的寿命、细胞的死亡、菌污染等问题。
为避免这些问题，需要在实验中采取一些必要的预防措施。
例如，可以使用无菌操作技术，采用CDMF等杀菌剂消毒培养器、培养器中的培养物料，这样可以有效防止细胞因菌污染而死亡。
二、细胞分离技术细胞分离技术是研究细胞的单个特性、形态和功能的一种技术。
在实验中需要利用细胞分离技术来获得一定数量的单个细胞。
细胞分离技术有多种方法，包括分离器分离、离心分离、胶体分离和酶消化等，每种方法都有其优缺点。
其中，酶消化是一种比较常见的细胞分离方法，通过加入一定量的酶，将组织内的胶原纤维、纤维素及其他基质物质消化掉，从而获得单个细胞。
在酶消化实验中，需要根据不同细胞类型、不同组织、不同生长状态等因素进行调整，以获得最佳效果。
三、荧光显微镜技术荧光显微镜技术是一种广泛用于生物学和生命科学中的高级显微镜技术。
在细胞生物学研究中，荧光显微镜技术是最常用的技术之一，因为它可以用来标记和检测细胞内的各种生物大分子，如蛋白质、核酸、酶等。
在荧光显微镜实验中，使用的荧光探针要与待检测的细胞相匹配，例如，使用荧光染料DPH来探测细胞内外膜分子的相互作用。
同时，还需注意荧光显微镜的光源选择、荧光图像的采集和分析等问题，以获得高质量的研究数据。
细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。
细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。
下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。
1. 胰蛋白酶（Trypsin）•在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。
让组织碎片沉淀，去除上清液。
重复清洗2到3次。
•将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。
加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。
•在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
•移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
•在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。
如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
•通过无菌不锈钢丝网（100〜200mm过滤，分散所有剩余组织。
计数和接种细胞，进行培养。
2. 胶原酶（Collagenase）•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片几次。
•加入胶原酶（50〜200单位/ml，溶解在HBSS中）。
•在37C孵育4到18小时。
加入3mM CaCI2增加解离效率。
•通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。
如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
•通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
•再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3. Dis pase•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
•加入Dispase （0.6〜2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液）•在37C孵育20分钟到几个小时。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
24
在4℃孵育6到18小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去 移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留 胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟 在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使
用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂
通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培 养
25
2. 胶原酶 (Collagenase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用Hanks'平衡液 （HBSS）清洗组织碎片几次
加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）
在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率
26
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎
包括胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶等。
23
1.胰蛋白酶 (Trypsin)
在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块， 重复清洗2到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成 1-2mm3小块。
将盛有组织碎片的容器臵于冰上。加入0.25％溶解在无钙镁的 平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。
分别制
备所需 浓度的
的单核细胞冲
落或用刮刀轻 刮，收集贴壁 的单核细胞。
培养皿以尽量洗下未贴壁细胞
（淋巴细胞）。
细胞悬
液。
9
黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞
因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于
尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），
所以可将其与T淋巴细胞分离。
10
具体步骤：
单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的 细胞悬液。
32
轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔2~3天换一次培养液
观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养
待细胞快长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养，
取第3~5代细胞用于实验
33
培养24h
培养96h
培养120h
34
举例（初步淋巴细胞分离法）：
放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛 有含5%小牛血清的D-Hank’s液（不含钙镁，含青霉素200kU· -1、链 L 霉素200mg· -1）平皿的网纱中（200目） L 用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中 溶液移入离心管中， 1200 rpm离心10min，弃上清， D-Hank’s液洗涤 细胞，加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度，进行培养
30
将培养液移至离心管中，1200rpm离心10min，弃上清 再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hank’s液4ml，培养消化30min
200目尼龙网纱过滤，1200 rpm离心10min，弃上清 将获得的细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h，弃去未黏附细胞
（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞
19
注意事项：
分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需 要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。
此法分离得到的T细胞纯度可达到99%,收获率可达到90%。
由于喷嘴孔很小（约70～100μm），分选前用30～40μm孔径的滤网 过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。
20
优缺点：
流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标
临床药理研究所
1
现代生物技术
基因工程技术
细胞工程技术
酶工程技术
发酵工程技术
细胞培养
2
从血液、体液中分离细胞
原代培养
从原代组织中分离细胞
从原培养容器中分离细胞 -- 传代培养
3
采血方法：
人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血； 小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺 法、断颈取血或股动脉放血。
18
流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：
密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107 /ml； 加适量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4℃孵育30min, 用RPMI-1640
培养基洗2次；
用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光 参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。
11
免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞：
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合 体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性 微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的 特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。
是能得到大量单细胞；
组织块法操作简单，实验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。
因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。
37
心肌细胞的酶消化培养法：
1.心肌组织的选择：
生后1~4天的Wistar乳鼠心脏等。
2.心肌组织块的制备：
稳定、高质量的分选：纯度（90-99%） 对细胞无损伤
分离效率较流式细胞仪分
选略低 且耗材相对较贵，适合无
操作简便、快速：消毒方便，手动分选30分钟内 完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。
从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个 细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。
12
免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗
特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应
后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、 分离的目的。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞
混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞 得以分离。
大型流式细胞仪设备且对分
选细胞纯度要求不高的分选。 只适用于简单标记的细胞 分离
分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞 培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞 组分均可回收利用。
从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还 可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、 RNA及mRNA。
枸橼酸钠法：先配制2%枸橼酸钠，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即 可抗凝；
EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/L EDTA 2µ l。
5
体液标本采集： 在局部70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔 （如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。
膝关节腔穿刺
胸腔穿刺
6
血样中红细胞和白细胞的分离：
利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉 降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。 抗凝血，室温或37℃下直立静臵30-60min，红细胞沉降至下层，中 间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血 与3%明胶（经灭菌消毒）等量或3︰l量混合于离心管中，直立静臵30-
动物的骨髓：可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培
养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。
22
制备细胞悬液方法：
将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用 的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离 细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细
胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。
先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤 维柱，冲洗液尽量流净。
将尼龙柱预温37℃，再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维 柱，不使流出，37℃温箱内静臵l小时。 取下注射针头，用预温37℃含20%小牛血清的RPM I-1640培养液冲 洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T淋巴细胞。 从注射器内取出尼龙纤维，在4℃的RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤 压，将黏附的B细胞洗脱收集（B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴 壁法将其分离）。 收集的T、B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮，洗涤，离心（250g， 7min），并重复洗涤3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制 备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液。
35
举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）： 基本原理：
心肌细胞培养方法有离体心脏灌注法、酶消化法和组织块法，将心
肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件 下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。
36
评价：
离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大;
酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但
60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。
7
血中单个核细胞的分离： 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在
1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。
淋巴细胞分离液
8
血中单核细胞的分离： 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离
多将悬液放入12cm直径的培养 单 个 核 细 胞 悬 液 皿中，于37℃培养箱中静臵3060min。此时单核细胞贴壁，而 淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴 壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗 用Hanks液强 力冲洗吹打与 震荡，将贴壁 计数后
在37℃孵育20分钟到几个小时。
28
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎
片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase
通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次
再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养