人外周血单核细胞分离技术
单核细胞处理过程
单核细胞处理过程以下将详细介绍单核细胞的处理过程，主要包括细胞分离、纯化和保存等步骤。
1. 细胞分离：单核细胞通常从外周血、骨髓或者组织中获得。
对于外周血单核细胞的分离，常用的方法有密度梯度离心和磁珠分离。
密度梯度离心是通过在离心过程中离心介质的密度差异，将单核细胞分离出来。
常用的离心介质如Ficoll-Hypaque。
磁珠分离是通过将针对单核细胞特异性抗体（如CD14抗体）结合在磁珠上，然后将其与细胞混合，利用磁力将单核细胞与其他细胞分开。
2.细胞纯化：分离得到的单核细胞通常含有其他细胞类型的污染物，如红细胞、淋巴细胞和血小板。
为了提高单核细胞的纯度，可以使用巨噬细胞亲和柱或负选择方法进一步纯化。
巨噬细胞亲和柱是一种利用巨噬细胞表面表达的特定受体与抗体结合的纯化方法。
常用的巨噬细胞亲和柱有CD14柱，可以高效地将单核细胞纯化。
负选择方法则通过使用针对非单核细胞特异性抗体和磁珠结合，将非单核细胞选择性地去除。
3.细胞保存：为了进行后续的实验操作或长期保存，单核细胞需要被储存。
常用的保存方法有冷冻和低温保存。
冷冻保存是将单核细胞在冷冻液中快速冷冻并保存在液氮或者低温冰箱中。
常用的冷冻液为含有10%二甲基亚砜（DMSO）和90%胎牛血清的培养基。
低温保存是将单核细胞在低温液态氮中保存，可以避免冷冻和解冻过程对细胞的损伤。
4.细胞培养：单核细胞可以通过培养来进一步研究其生物学特性和功能。
常用的培养基为RPMI1640，其中添加胎牛血清、抗生素和细胞增殖剂等。
为了促进巨噬细胞的分化，还可以添加刺激因子，如大肠杆菌脂多糖（LPS）。
培养过程中，需要定期更换培养基并观察细胞的生长情况。
5.细胞实验：处理得到的单核细胞可以用于各种实验，如流式细胞术、酶联免疫吸附实验（ELISA）和功能实验等。
例如，流式细胞术可以用于检测单核细胞表面分子的表达水平，从而研究其分化和激活状态。
ELISA可以用于检测细胞培养上清液中的细胞因子水平。
人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
⑥加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
⑦加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
⑧细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
ficoll分离法分离pbmc
ficoll分离法分离pbmcFicoll分离法分离PBMC的介绍PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell），又称外周血单个核细胞，是人体免疫系统中重要的组成部分。
PBMC中包含淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等，是研究免疫学、血液学和生物学的重要细胞。
对PBMC的分离和纯化对于后续的实验研究有着至关重要的作用。
其中，Ficoll分离法是常用的PBMC分离方法之一，其通过悬浮PBMC在密度梯度上，利用真核细胞和其它细胞在稀释Ficoll溶液中的胶体压差选择性沉降，从而获得纯净的PBMC。
下面，本文将详细介绍Ficoll分离法分离PBMC的步骤和特点。
一、操作步骤1、制备样本：以抗凝剂抗凝的外周血为样品。
2、制备Ficoll-Paque溶液：5ml Ficoll-Paque液加5ml PBS进行混合。
3、样本的悬浮液：将5ml抗凝的外周血加入到50ml 耐酸碱离心管内。
缓慢倒入Ficoll-Paque溶液，避免两种溶液混合。
装好离心管盖，以3000r/min离心30min（制备不同量的悬浮液时离心的时间不同），过程中不能震动，最好在无扰动的条件下离心。
4、取上清液：离心结束后，可以清晰地看到上清液、白膜和红血块。
样品中的细胞被Ficoll在稀释液中的胶体压力亲和力离心到离心管的木纹间。
无线假底离心管是离心过程中压力拍打细胞下沉粘连的机会最小的离心材料。
在冰上开盖依次取出，将悬浮液上清液倒在装有PBS的无菌离心管中。
5、PBS的加入：加入PBS，摇匀，离心1800r/min，10min。
取出，弃上清液。
6、PBS的加入和离心：重复上一步2次。
最后一次离心弃掉PBS，留下沉淀细胞。
二、特点1、相对纯净度高：Ficoll-Paque是一种密度梯度介质，利用细胞的沉降速度和浮力进行分离。
使不同密度的细胞分层，从而实现分离。
使用该分离方法分离PBMC，可获得高度纯净的细胞，最大限度减少不同细胞系之间的干扰。
ficoll密度梯度离心法分离pbmc
ficoll密度梯度离心法是一种常用的细胞分离技术，尤其在分离外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）时被广泛应用。
该技术通过梯度离心的原理，能够将不同密度的细胞分离开来，从而得到高纯度的目标细胞。
本文将从原理、操作步骤及应用方面对ficoll密度梯度离心法分离PBMC进行介绍。
一、原理1. ficoll密度梯度离心法的原理ficoll密度梯度离心法是基于不同细胞在不同密度梯度离心条件下会沉降到不同层级的原理。
ficoll是一种聚合物，在水溶液中形成梯度，形成浓度递增的梯度。
当混有不同密度的细胞悬液样本在ficoll梯度上离心时，密度较高的细胞沉淀到ficoll浓度较高的层次上，而密度较低的细胞则会沉淀到ficoll浓度较低的层次上，从而实现了不同细胞的分离。
2. ficoll密度梯度离心法分离PBMC的原理在分离PBMC时，PBMC是由淋巴细胞和单核细胞组成的一种混合细胞悬液。
在ficoll密度梯度离心法中，PBMC会在ficoll的适当浓度层次上形成特定的固定位置，而其他细胞则会分布在不同的ficoll浓度层次上。
通过调整ficoll梯度的浓度，即可使PBMC在特定位置上沉淀，从而实现PBMC的分离。
二、操作步骤1. 制备ficoll梯度液将ficoll粉末加入等体积的PBS缓冲液中，充分溶解并混匀，得到ficoll梯度离心所需的溶液。
2. 取样、稀释取外周血样本，加入适量的PBS缓冲液稀释，使细胞密度均匀并不超出离心设备的容量。
3. 加样将稀释后的外周血样本缓慢地加入到制备好的ficoll梯度液上，避免产生气泡并保持悬液的均匀性。
4. 离心分离将加样后的离心管放入离心机中，进行高速离心。
离心过程中，细胞会根据密度在ficoll梯度上分层沉淀，形成不同层次的细胞带。
5. 取样离心结束后，用吸管或移液器沿着管壁取下PBMC所在的ficoll层次，并转移至新的离心管中。
应用流式细胞分选技术分离人外周血原代单核细胞
摘
要 巨噬细胞 是机 体重要 的免疫细胞 ， 具有免疫调 节 、 抗感染和 抗肿 瘤等 重要功 能。快速、 有效地分 离得 到高 纯度 的人
外周血单核 细胞 ， 是研 究巨噬细胞 功能的前提 。利用 细胞 大小及 胞 内颗粒 度属 性对 单核细 胞 与其 他 白细胞 组分进 行 区分。 通过流 式细胞 分选 ， 获得 了较高 纯度 单核 细胞 。单核细胞表面标 志物 Ｃ １ Ｄ ４染色分 析显 示， 方法对单核 细胞 的分选 效率达 该 ８ ％ 以上。进一步实验证 明， ５ 分选得到 的单核细胞 能够在体 外正常分 化为 巨噬细胞。 关 键词 人外周血 原代 单核 细胞 流式分选
第 １ ２卷
第２ ４期
２１ ０ ２年 ８月
科
２ Ｎｏ ２ Ａｕ ．２ １ １１ ．４ ｇ ０２
ｌ７ — １ １ （ ０ ２ ２ ５ ８ —４ ６ １ ８ ５ ２ １ ） ４— ９ ５ ０
Ｓｃｅ ｃ ｃ ｎｏｏ ｙ ａ ｄ Ｅｎ ｉ ｅ ｒｎｇ ｉ ｎ ｅ Ｔｅ ｈ ｌ ｇ ｎ ｇ ｎ ｅ ｉ
ｒ ｈ ｒｌ ｌ ｄｍ ｎ ｎ ｃ ａ ｅ ，Ｐ ＭＣ） 要 包 括 淋 ｉ ｅａ ｂｏ ｏ ｏ ｕｌ ｒ ｌ Ｂ ｐ ｏ ｅ ｃｌ 主
对 于单 核 一 巨噬细胞 相关 研究 的 开展至 关重 要 。 单核 细胞 是体 积 最 大 的 白细胞 ， 内容 物 的颗 其 粒 形 状与 淋 巴细胞 以及 粒 细 胞 等具 有 显 著 的差别 。
中图法分类号
Ｒ ３ ．４； ３１１
文献标志码
Ｂ
巨 噬细胞 （ ｃｏ ｈ ｇ ） Ｍａｒｐ ａｅ 能吞 噬感 染异 物 并 诱导 Ｔ细 胞活 化 ， 动 免 疫 应 答 ｌ ， 机 体 损 伤 修 复 、 启 １在 ｊ 抵 抗 病 原入侵 等 方 面起 重 要 作 用 ， 是机 体 先 天免 疫 的重要 部 分 。巨 噬 细 胞 属 于无 颗 粒 白细 胞 的一
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离及其寿命外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)外周血单个核细胞外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
分类表：血细胞寿命1、红细胞-携带氧的“运输兵”红细胞是血细胞中最多的细胞，内含血红蛋白，它能把人体从肺部吸入的氧气结合后，通过备注徨再释放给各组织，因此被称为携带氧气的“运输兵”。
红细胞的平均寿命为120天，每天均有细胞衰老、死亡、也就是说，每天约有20亿个红细胞死亡。
2、白细胞—人体健康的“卫士”白细胞能吞噬进入人体的细菌和病毒以及代谢产生的对人体有害的“异物”，白细胞还有免疫功能。
白细胞的平均寿命很短，约7-14天。
粒细胞在骨髓内经10天左右释放入血液，在血液不到1天然后溢出血管进入组织或体腔内。
在组织或体腔内可以行使防御功能2－3天。
素爱老的粒细胞被单核-巨噬细胞系统清除，也有一部分从口腔、气管、消化道和泌尿生殖道排出。
淋巴细胞：B淋巴细胞寿命较短，一般3－4天，景观抗原刺激后分化为浆细胞，产生特异性抗体，参与体液免疫。
T淋巴细胞寿命较长，可达数月，甚至数年，经抗原致敏后，可产生多种免疫活性物质，参与细胞免疫。
免疫实验 人外周血单核细胞分离
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验 细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异 始 应h合性 母 答o c成抗 细 功yte
二 、 B细胞 增殖 试验
B 细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高 R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
酶联免疫斑点法 （En zym e-Link edImm un o spo t,
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人外周血单核细胞分离
1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血
A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。
2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀
A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。
B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。
另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。
此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。
与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。
管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜
3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁
吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。
加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。
混匀后离心1500r/min离心
10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。
注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。
第二种方法，比较简单一些。
再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。
再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。
按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640液3～4 mL) 重新混悬细胞37℃、5% CO2孵育箱中培养2 ～3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。
于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液3～4 mL，按需调定细胞密度, 于37℃、5% CO2孵育箱中培养备用。
4. 单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定
取一定体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56 等检查,以测定所得细胞的纯度。
取1 滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。
以台盼蓝拒染法检测细胞活力。
取1滴细胞悬液加1 滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。